(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811195565.4
(22)申请日 2018.10.15
(71)申请人 清华大学
地址 100084 北京市海淀区清华园1号
(72)发明人 常智杰 朱丙陶 丁莉丹 王银银
任芳丽 杨柳
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 关畅 魏少伟
(51)Int.Cl.
C12N 15/85(2006.01)
C12N 15/90(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
(54)发明名称一种细胞周期调控蛋白CREPT在动物胚胎干细胞多能性维持中的应用(57)摘要本发明公开了一种细胞周期调控蛋白CREPT 在动物胚胎干细胞多能性维持中的应用。本发明发现降低胚胎干细胞中细胞周期调控蛋白CREPT 的含量后动物胚胎干细胞增殖和多能性维持均受到影响，导致动物胚胎干细胞的增殖、自我更新能力和嵌合能力均受到抑制(CREPT敲除的胚胎干细胞不能嵌合到子代胚胎组织中)，从而不能分化为胚胎。表明，细胞周期调控蛋白CREPT可以维持动物胚胎干细胞的多能性，可以通过降低其表达制备具有增殖能力下降和/或自我更新能力下降和/或嵌合能力下降特征的非人动物胚胎 干细胞模型。
权利要求书2页 说明书7页序列表35页 附图1页CN 109295090 A 2019.02.01 C N 109295090
A
1.具有如下1)和/或2)和/或3)特征动物胚胎干细胞模型的制备方法：
1)增殖能力下降；
2)自我更新能力下降；
3)嵌合能力下降；
所述方法包括：降低或抑制离体的出发动物胚胎干细胞中CREPT蛋白质的含量和/或活性，得到与所述出发动物胚胎干细胞相比增殖能力和/或自我更新能力和/或嵌合能力下降的动物胚胎干细胞模型；所述动物为非人动物或人。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CREPT蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述动物为非人哺乳动物或人。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述降低出发动物胚胎干细胞中CREPT蛋白质的含量和/或活性通过降低或抑制所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因的表达实现。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述降低或抑制所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因的表达通过敲除所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因或其任一片段或向所述出发动物胚胎干细胞中导入抑制所述CREPT蛋白质的编码基因的物质实现。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述敲除所述CREPT蛋白质的编码基因或其任一片段利用Cre-loxp方法实现。
7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备的动物胚胎干细胞模型。
8.权利要求1或2所述CREPT蛋白质或与所述CREPT蛋白质相关的生物材料在调控动物胚胎干细胞增殖能力和/或自我更性能力和/或嵌合能力中的应用；所述动物为非人动物或人；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码所述CREPT蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因动物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因动物器官；
B8)降低所述CREPT蛋白质表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因动物细胞系、转基
因动物组织或转基因动物器官。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列1所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CREPT 蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述CREPT蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述动物为非人哺乳动物或人。
一种细胞周期调控蛋白CREPT在动物胚胎干细胞多能性维持
中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及细胞生物学技术领域中，一种细胞周期调控蛋白CREPT在动物胚胎干细胞多能性维持中的应用。
背景技术
[0002]干细胞(Stem cell)即未分化的细胞，它是一类能够自我更新(self-renewal)和分化形成功能性细胞的多潜能细胞。按照不同的分类标准，干细胞可分为不同的类型，如根据干细胞所处的发育阶段不同可分为胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和成体干细胞(Somatic stem cell)；根据干细胞所具有的分化潜能可分为全能干细胞(Totipotent Stem Cell，TSC)、多能干细胞(Pluripotent stem cell)、专能干细
胞(Multipotent stem cell)和单能干细胞(Unipotent stem cell)。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞，可以分化形成人体各种类型的细胞，具有发育的全能性，为医学移植疾病带来了便利。胚胎干细胞的全能性赋予了其在发育上的巨大可塑性，而正是这种可塑性给人们在对其分化的控制上带来了挑战，如何按照人们的意图有效控制干细胞的定向分化成了目前急需解决的问题，这一问题的解决将会进一步促进胚胎干细胞的应用。
[0003]胚胎干细胞多能性的维持是一个多蛋白参与的综合调控的过程，其中包括转录因子、衔接蛋白、染质重塑酶和染质结构调节蛋白等。许多肿瘤相关基因，如c-Myc、Klf4、STAT3等，均在胚胎干细胞多能性维持上发挥重要功能。CREPT(Cell-cycle Regulated and Expression-elevated Protein in Tumor)是近年申请人克隆并命名的一个新基因(Gene ID：58490)，它能够促进肿瘤的增殖和转移，是一个新的肿瘤相关基因。
发明内容
[0004]本发明所要解决的技术问题是如何制备具备增殖能力下降、自我更新能力下降和/或嵌合能力下降的动物胚胎干细胞模型。
[0005]为解决上述技术问题，本发明首先提供了具有如下1)和/或2)和/或3)特征动物胚胎干细胞模型的制备方法：
[0006]1)增殖能力下降；
[0007]2)自我更新能力下降；
[0008]3)嵌合能力下降；
[0009]所述方法包括：降低或抑制离体的出发动物胚胎干细胞中CREPT蛋白质的含量和/或活性，得到与所述出发动物胚胎干细胞相比增殖能力和/或自我更新能力和/或嵌合能力下降的动物胚胎干细胞模型；
[0010]所述动物为非人动物或人。
[0011]所述出发动物胚胎干细胞表达所述CREPT蛋白质。
[0012]上述方法中，所述CREPT蛋白质可为如下A1)、A2)或A3)：
[0013]A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
[0014]A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0015]A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0016]为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0017]表：标签的序列
[0018]
标签残基序列
Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRR
Poly-His2-10(通常为6个)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
HA9YPYDVPDYA
[0019]上述A2)中的CREPT蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。[0020]上述A2)中的CREPT蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3所示的CREPT蛋白质。
[0021]上述方法中，所述动物可为非人哺乳动物或人。所述非人哺乳动物进一步可为小鼠。
[0022]上述方法中，所述降低出发动物胚胎干细胞中CREPT蛋白质的含量和/或活性可通过降低或抑制所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因的表达实现。[0023]上述方法中，所述降低或抑制所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因的表达可通过敲除所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因或其任一片段或向所述出发动物胚胎干细胞中导入抑制所述CREPT蛋白质的编码基因的物质实现。
[0024]所述降低或抑制所述出发动物胚胎干细胞中所述CREPT蛋白质的编码基因的表达具体可敲除所述CREPT蛋白质的编码基因的外显子。所述CREPT蛋白质的编码基因的外显子可为所述CREPT蛋白质的编码基因的第三个外显子。
[0025]所述CREPT蛋白质的编码基因可为序列表中序列2所示的DNA分子，所述CREPT蛋白质的编码基因的基因组序列为序列表中序列1所示的DNA分子。序列1的第1-459位为第一个外显子的序列，第7500-7692位为第二个外显子的序列，第14910-15043位为第三个外显子的序列，第19423-19532位为第四个外显子的序列，第21591-21717位为第五个外显子的序列，第30156-30331位为第六个外显子的序列，第46434-49711位为第七个外显子的序列。[0026]上述方法中，所述敲除所述CREPT蛋白质的编码基因或其任一片段可利用Cre-
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