(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 103627758 A (43)申请公布日 2014.03.12 |
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(21)申请号 CN201210311131.2
(22)申请日 2012.08.28
(71)申请人 天士力制药集团股份有限公司
地址 300410 天津市北辰区淮河道与汀江西路交口天之骄园区法务中心知识产权部
(72)发明人 范宝庆 李亚冰 孙倩 李军强 曹小丹 金永杰 赵秋敏 刘贺军 李剑
(74)专利代理机构 北京华科联合专利事务所(普通合伙)
代理人 王为
(51)Int.CI
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种CRM197蛋白的生产方法，属于生物医药制造领域，其过程包括：种子液的制备CRM197发酵培养、离心去除菌体、发酵液预处理、Toyopearl DEAE-650S离子交换进行捕获、Butyl sepharose 4B进行疏水纯化、超滤浓缩换液（冻干）；其中疏水纯化之后蛋白纯度不低于95％，由此确立了合理的发酵和纯化工艺路线以及相应的工艺参数，有利于工艺的放大和规模化生产。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种CRM197蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1）采用白喉棒杆菌（Corynebacterium diphtheriae）进行发酵培养；
2）发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；
3）经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；
4）浓缩液经硫酸铵两次盐析后对沉淀进行复溶；
5）复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白；
6）捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化；
7）浓缩至所需浓度保存。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1所述白喉棒杆菌选自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC 39255、ATCC39526、ATCC 11049、ATCC51926或ATCC51280中的一种；优选ATCC39255或ATCC51280。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1所述白喉棒杆菌的培养方式为：1）将种子液接种至含CY培养基的发酵罐中，接种量为5％，在34．5℃，以亚硫酸钠饱和溶液标定溶氧电极0％，在300rpm，罐压维持0．1Mpa，通气量0．75m<sup>3</sup>/h的条件下标定溶氧为100％，维持整个培养过程中的溶氧不低于3％，维持发酵液pH为7．4，直至生物量不再增加；2）在菌体进入稳定期后发酵液蛋白pH开始上升，蛋白开始表达，此时控制发酵液pH为7．6以发酵液溶氧迅速上升为发酵终点。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4中的两次盐析过程为，超滤浓缩液采用20-50％饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后用60-85％饱和硫酸铵对上清液进行第二次盐析。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5中的离子交换谱为阴离子交换，阴离子谱填料为：Toyopearl DEAE-650S、DEAE．Fratogel EMD、Q．Sepharose．FF、CaptoQ Seharose．FF；优选：Toyopearl DEAE-650S、Capto QSepharose．FF。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5中的离子交换过程为二次盐析沉淀复溶液经10-50M PB缓冲液超滤换液至Cond 10．0-2．0，pH调节至7．0-8．0上阴离子交换柱；洗脱液为：10mM-100M PB+0．5M KCL,采用梯度洗脱或25％B一步洗脱。 7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤6中的疏水纯化所用其疏水填料为：Toyopearl Phenyl-650、 EMD Propyl(S)、Phenyl．Sepharose．6FF(high sub)、Butyl sepharose 4FF；疏水填料优选：ToyopearlPhenyl-650、Phenyl．Sepharose．6FF(highsub)。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤6中的分离纯化过程中的平衡缓冲液为10～100mM PB，pH 7．0～7．6，1～2M硫酸铵；洗脱缓冲液为10～100mM PB，pH 7．0～7．6；洗脱方式为梯度洗脱或者两阶梯等度洗脱，其中两阶梯等度洗脱第一次洗
脱的缓冲液为：10～50mM PB，pH 7．0，0．3-1．5M硫酸铵。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：平衡缓冲液为10～50mM PB，pH 7．0，1．5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10～100mM PB，pH 7．0～7．6；洗脱缓冲液为10～50mM PB，pH 7．0，洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mM PB，PH 7．0，1．05M硫酸铵。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤7中所述浓缩为步骤6所得的纯化后的蛋白液，采用10kDa或30kDa,超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后保存方法为，加入1％～5％的抑肽酶和10～20umol/L EDTA后，-20℃冻存或者加入1％～5％的抑肽酶和10～20umol/L EDTA后再加入1％-5％的蔗糖乳糖或麦芽糖冻干保存。
说 明 书
<p>技术领域：
本发明涉及一种疫苗制备方法，特别涉及一种疫苗的载体蛋白CRM197蛋白 的生产方法，属于生物医药制造领域。
背景技术：
随着我国对公共卫生安全的关注度的提高，尤其是对疾病预防为主策略的确 立，使得我国的疫苗事业迅速发展。近年来，多糖结合疫苗技术逐渐成熟，已被 广泛应用到多种疾病的预防控制中。多糖结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价 结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，能够使多糖由T细胞非依赖 性抗原转化为T细胞依赖性抗原，从而增强多糖的免疫原性，更好地诱导机体产 生免疫记忆反应，使机体获得免疫持久性，从而实现多糖抗原免疫原性的提高。
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