(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 1092108 A (43)申请公布日 1994.09.14 |
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(21)申请号 CN94100594.1
(22)申请日 1994.01.28
(71)申请人 中国科学院微生物研究所
地址 100080 北京市海淀区中关村北一条13号
(72)发明人 陈远童 刘挺 庞月川 郝秀珍
(74)专利代理机构
代理人
(51)Int.CI
C12P7/44
C12N1/14
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种利用微生物发酵生产长链α， W-二羧酸的方法，特别是高产十五碳二羧酸(DC | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
<Claim>1、一种利用微生物发酵生产C<Sub>11</Sub>-C<Sub>17</Sub>长链α，W-二羧酸的方法，其特征在于它包括在以C<Sub>11</Sub>-C<Sub>17</Sub>的正烷烃为基质的培养基中，用热带假丝酵母(Candida>2、根据权利要求1的方法，其特征在于所说的C<Sub>11</Sub>-C<Sub>17</Sub>的α，W-二羧酸为十五碳二羧酸，所说的正烷烃为正十五烷。
<Claim>3、热带假丝酵母（Candida tropicalis）NP-6-126，即CGMCC NO.0206菌株。
说 明 书
本发明涉及微生物发酵正烷烃生产长链α，W-二羧酸，尤其是发酵正十五烷，高产十五碳二羧酸的方法。
长链二羧酸是合成香料，尼成工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂等的重要原料。十二个碳以上的长链二羧酸，自然界中不存在，化工上也还没有经济可行的合成方法，因此利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下，转化石油中的正烷烃，生产长链二羧酸早已引起科学家们的重视和深入研究。
十五碳二羧酸是合成名贵香料环十五酮和麝香酮（即3-甲基-环十五酮）的重要原料，后者是天然麝香的主要成分之一。以人工合成的麝香酮代替稀罕难得的天然麝香，配制多种中成药，临床应用试验表明，疗效与天然麝香一样显著。
正十五烷也是微生物容易同化的一种烷烃，因此形成和积累十五碳二羧酸，特别是高产十五碳二羧酸比较困难。
在专利文献中，虽有有关利用微生物从正烷烃发酵生产长链二羧酸的方法，但还没有有关从正十五烷发酵生产十五碳二羧酸，特别是高产十五碳二羧酸的方法。在US4339536中，只有
生产十二碳和十三碳二羧酸的实施例，而且产酸水平不高，只达到45g/L;而在US4624920中，只有在50ml和500ml摇瓶生产十四碳和十六碳二羧酸的实施例，且产酸水平太低，每升发酵液只有3mg;申请号为87105445和89102548的中国专利申请，主要是有关生产十六碳和十七碳二羧酸的方法，在16L罐上，产酸量分别为120g/L和133g/L。
日本植树南海男等人报道过用一株热带假丝酵母突变株M<Sub>2030</Sub>从正十五烷生产十五碳二羧酸，在3升罐上，产酸达到90g/L左右;上海沈永强等人报道过用一株热带假丝酵母N-15的高浓度静止细胞（菌浓为15×10<Sup>8</Sup>个/毫升）转化正十五烷为十五碳二羧酸时达到109g/L，（《植物生理学报》1980.Vol.6，No：1）。但实验室发酵试验时，发酵8天，DC<Sub>15</Sub>的产量只达到77.2g/L。其他有关发酵生产十五碳二羧酸的报道都只有40-50g/L。因此用微生物发酵高产出地生产DC<Sub>15</Sub>是一个仍需解决的问题，本发明的目的是提供一种生产C<Sub>11</Sub>-C<Sub>17</Sub>单一长链二羧酸和混合长链二羧酸的方法，特别是高产出地生产DC<Sub>15</Sub>的方法。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母（Candida tropicalis）NP-6-126，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母（参见《微生物学报》20（1）：88-93，1980）为出发菌株，
通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C<Sub>11</Sub>-C<Sub>17</Sub>的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十五烷，高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母NP-6-126（以下简称NP-6-126）保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC><p>NP-6-126的生理特性如下：
一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。
二、同化，葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糖醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。
三、生长素的需要：生物素++，维生素B<Sub>1</Sub>++，维生素B<Sub>2</Sub>+，维生素B<Sub>6</Sub>+，维生素B<Sub>12</Sub>+，叶酸+，烟酸+，泛酸十，肌醇十，对氨基苯甲酸十。
四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛级-，油脂酶-。
形态特征：奶油白，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征：
在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长;在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝;而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭园细胞。
本发明的种子培养基：（1）、10个巴林糖度的麦芽汗加2%琼脂制成的固体斜面;（2）、10个巴林的麦芽汁液体培养基;（3）烷烃种子培养基包含：KH<Sub>2</Sub>PO<Sub>4</Sub>6-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蜡或正十五烷40-70ml/L，自来水配制，自然pH。
培养种子的过程为：取一接种环NP-6-126酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上（15×180试管，每支装6-7ml培养基，放成斜面），于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的NP-6-126菌种全部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中，于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或者取两支上述培养好的NP-6-126菌种全部刮入装有500ml培养基的5000ml三角瓶中，于180转/分旋转摇床上28-30℃培养44-48小时，作为一级种子罐的种子。
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