(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810888146.2
(22)申请日 2018.08.07
(83)生物保藏信息
CGMCC No.15923 2018.06.11
(71)申请人 宁夏大学
地址 750021 宁夏回族自治区银川市西夏
区贺兰山西路489号
(72)发明人 剧柠 赵梅梅 王雪蓉 张喻琳
胡婕
(74)专利代理机构 宁夏合天律师事务所 64103
代理人 周晓梅
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
A23L 13/70(2016.01)
C12R 1/25(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及微生物技术领域，提出一种植物
乳杆菌菌种及其应用，采用所述植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum)对腌制牛肉进行发 玫瑰红，脂肪白；弹性较好，切面坚实整齐；
具有柔和的芳香味酸甜适中。权利要求书1页 说明书11页 附图20页CN 108977380 A 2018.12.11
C N 108977380
A
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌种，所述菌种于2018年6月11日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.15923。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在发酵中式腌制牛肉中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108977380 A
一种植物乳杆菌菌种及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌菌种及其应用。
背景技术
[0002]发酵肉制品是指自然或人工控制条件下，利用微生物发酵作用生产的具有 特殊风味、泽和质地，且具有较长保存期的肉制品。通过微生物发酵，使原 料的质地得到改善，风味有所增加，营养价值得到提高。在发酵肉制品整个加 工过程中，肉类本身内源酶和微生物酶会分解蛋白质产生大量的氨基酸， 从而 提高了人体对发酵肉制品的消化性。而这些游离氨基酸，很多都是人体需要的 必需氨基酸，有明显的生物活性，这使得肉制品的保健性和营养性得到很大的 提高。氨基酸本身或与其他物质反应产生风味物质，促进肉制品的香气和滋味。 同时，肉制品中一些的氨基酸与其他物质复合可以起到抗氧化作用，以及作为 发助剂改善发酵肉制品的感官，对肉制品的品质产生影响。
[0003]我国肉制品分为西式肉制品和中式肉制品两大类。西式肉制品以灌肠、火 腿、培根三类产品为主，中式肉制品包括腌腊类制品、肉类干制品和酱制品三 类产品。西式发酵肉制品工业化生产较为成熟，但产品多不符合国人饮食习惯。
[0004]中式肉制品虽然在少数民族聚居区有着食用发酵肉制品的悠久历史，但多 为地方产品，受当地环境和气候的限制。传统的腌肉制品，一般以猪肉为原料， 在自然状态下利用微生物进行厌氧发酵而制成。存在以下问题：一方面猪肉脂 肪含量高，易导致肥胖和心血管疾病，另一方面自然发酵周期长，控制不好极 易污染杂菌。
[0005]牛肉富含矿物质、B族维生素、钾、铁、锌等营养要素，提供高质量的蛋 白质。较猪肉比，蛋白质含量高5-10％，脂肪含量低20-30％。市场上目前牛肉 发酵制品，以风干牛肉为主，属于轻度发酵产品。缺乏深度发酵的牛肉制品。
[0006]目前市场上存在的各类商用发酵肉菌种，生产公司和产品种类较为丰富， 且多以直投试发酵为主，
操作简便。但是这些菌种大多属于西式发酵肉用菌种， 中式发酵肉用菌种很少见。
[0007]腌肉属中式发酵肉制品，通常采用自然发酵，生产周期长，易污染杂菌。[0008]现有商用发酵剂多用于西式发酵肉制品，生产的产品易出现风味同一，无 特的问题。另外，市场上专用中式发酵肉制品的发酵剂少有，要想将中式发 酵肉商业化需要开发相应的发酵剂。
[0009]牛肉经发酵可引起牛肉中蛋白质变性和降解，转化为胨、肽、氨基酸等物 质，既改善产品质地，使营养更加丰富，也提高了蛋白质的吸收率，更易被人 体吸收利用。但市场上关于牛肉的深度发酵产品不多。
发明内容
[0010]有必要提出一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌种，所述菌种于 2018年6月11日保藏于地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微 生物菌种保藏管
理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15923。
[0011]还有必要提出一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌种在发酵中式腌 制牛肉中的应用。
[0012]采用本发明提出的菌种对中式腌制牛肉进行发酵，得到的发酵牛肉产品形 状规则，表面肌肉呈玫瑰红，脂肪白；弹性较好，切面坚实整齐；具有柔 和的芳香味酸甜适中。
[0013]这与现有技术中对西式肉类进行发酵的发酵菌种是不同的，是一种中式腌 制牛肉专用型发酵菌。
附图说明
[0014]图1为筛选的得到的发酵乳酸菌P6在100倍油镜下的个体形态。
[0015]图2为筛选的得到的发酵乳酸菌K12在100倍油镜下的个体形态。
[0016]图3-图6为不同菌种、不同发酵时间对发酵腌牛肉品质的影响的感官评价 柱状图。依次为L3、K12、P6、ZC4。
[0017]图7-图10为不同菌种在不同温度下感官评价和pH变化情况柱状图。
[0018]图11-图14为不同菌种在不同湿度下感官评价和pH变化情况柱状图。
[0019]图15-图18为不同菌种在不同接种量下感官评价和pH变化情况柱状图。
[0020]图19-图24为乳酸菌产粘实验结果显示图。
[0021]图25-30为乳酸菌产气实验结果显示图。
[0022]图31、32为乳酸菌的产H2S实验结果显示图。
[0023]图33为4株菌的生长曲线图。
具体实施方式
[0024]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合实施例和实验方 案进行说明。
[0025]一、菌种来源
[0026]P6：宁夏银川地区市民家自然发酵泡菜中分离筛选得到。
[0027]K12：市售产自西藏林芝地区的藏灵菇菌种自然发酵乳中分离筛选得到。[0028]二、菌种分离筛选方法
[0029]1、浇注平板：将三角瓶中的已灭菌的MRS+0.5％碳酸钙琼脂培养基及MSA琼 脂培养基，加热熔化，冷却至45℃左右，浇注平板，每个平板约20mL。
[0030]2、样品稀释：取1mL上述的市售藏灵菇菌种自然发酵乳和1mL的自然发酵泡 菜汁，分别加入9mL无菌水，制成稀释度为10-1的发酵菌悬液和泡菜汁菌悬液， 分别继续取稀释液1mL放于无菌试管中，加9mL无菌水，混匀，依次做10倍 的系列稀释，分别取少量稀释度的发酵菌液和泡菜汁菌液做发酵乳酸菌的分离。 3、平板分离：A.平板划线接种：分别用接种环挑取发酵菌液和泡菜汁菌液各一 环，无菌操作
在平板上进行划线接种；划线完毕后，盖上盖，倒置在40℃恒温 培养箱中培养48h。B.平板涂布接种：取两个无菌平板，在两个无菌平板上分别 加0.1mL发酵菌液和泡菜汁菌液，用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀， 平放于实验台上20min，然后倒置于25℃恒温培养箱培养48h。
[0031]4、观察菌落：选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步出 发酵乳酸菌菌落。(MRS+0.5％碳酸钙固体培养基筛选标准：在培养基表面或内 部生长良好，白有光泽，边缘整齐，易挑不粘连，有透明圈。MSA固体培养 基筛选标准：在培养基表面生长良好，白有光泽，边缘整齐，易挑不粘连。) 5、镜检：从平板上用接种环挑取菌落，制菌涂片，用革兰氏染，油镜观察得 到两种形态的菌种P6和K12，两种菌种的个体形态图片。如图1、图2。
[0032]三、菌种鉴定及结论
[0033]对获得的两种个体形态的菌种进行取样标号，分别为K2、K3、K5、K10、 K12、K13、K17、K18、K19、K20、K21、K22、L1、L2、L5、FX3、ZC4、ZC5、 ZC7、FXH11、FH2、FH6、P6、P7、Y4、Y6、Y9、Y10、L3、L7。
[0034]对以上这些菌种依次进行下述的(四、菌种特性对比实验)中的七种对比 实验，以及对筛选后的4株菌种分别进行(五、单一菌株的发酵实验)，得到菌 种P6和K12的各项特性均显著优于其他菌种，P6和K12对腌制牛肉发酵的效 果是最佳的。
[0035]对菌种P6和K12进行分子生物学鉴定，采用16S rDNA扩增过后测序，经 测序结果与BLAST数据库中的序列作对比，最终获得两株菌的鉴定结果：菌株 P6鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株；K12鉴定为植物乳 杆菌(Lactobacillus plantarum)。见菌株P6的16S rDNA序列和菌株K12的16S rDNA序列。
[0036]四、菌种特性对比实验及结论
[0037] 4.1、菌株特性
[0038](1)Leuconostoc mesenteroides P6和Lactobacillus plantarum K12均可耐受 6％氯化钠溶液，即在含6％NaCl的MRS液体培养基中37℃培养24h，600nm 下OD分别可达2.360和2.351。
[0039](2)Leuconostoc mesenteroides P6和Lactobacillus plantarum K12可耐受亚 硝酸钠溶液，即在含150mg/kg的MRS液体培养基中37℃培养24h，600nm下 测定OD值分别2.517和2.611。
[0040](3)Leuconostoc mesenteroides P6和Lactobacillus plantarum K12在MRS 液体培养基中37℃培养28h后，pH值分别降至3.78和3.71。
[0041](4)两株菌在MRS固体平板培养基上，37℃培养48h，菌落无产粘情况 出现。[0042](5)两株菌接种在装有杜氏小管的葡萄糖产气培养基中，37℃培养24h， 均无产气现象发生。
[0043](6)两株菌穿刺接种在产H2S培养基中，37℃培养24小时，无黑沉淀 线出现，不产生硫化氢。
[0044](7)用牛津杯在含有10％脱脂乳的MRS固体平板培养基上中打孔，分别在孔内加入 100μL上述两株菌种乳酸菌液，24h后观察酪蛋白的水解能力强。
[0045]即：以上试验结论是通过以下七组对比试验来验证Leuconostoc mesenteroides P6和Lactobacillus plantarum K12具有耐盐性高、耐亚硝酸钠高、 产酸高、不产粘液、不产气、不产硫化氢气体、蛋白质活性降解好的优良特性。
[0046](1)乳酸菌的耐盐实验方案与试验数据，见表1。
[0047]把乳酸菌接种在添加2.0％、4.0％、6.0％NaCl的MRS液体培养基中，37℃ 培养
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