(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910949562.3
(22)申请日 2019.10.08
(71)申请人 广州暨南大学医药生物技术研究开
发中心
地址 510000 广东省广州市天河区华景路
37号3层
(72)发明人 项琪 黄亚东 程雅婷 曹苗苗
(74)专利代理机构 广州市深研专利事务所
44229
代理人 姜若天
(51)Int.Cl.
C07K 14/78(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于基因工程领域，更具体地公开了
一种重组人纤连蛋白肽。本发明公开的是密码子
优化的重组人纤连蛋白肽基因，通过基因工程的
方法在体外进行表达纯化。本发明提供的利用大
且保留了纤连蛋白原本特性，可促进细胞生长，
提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平的重组人纤
连蛋白肽。权利要求书1页 说明书4页序列表3页 附图4页CN 110577592 A 2019.12.17
C N 110577592
A
1.一种重组人纤连蛋白肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组人纤连蛋白肽，其还包括用于蛋白纯化的His标签。
3.编码根据权利要求1或2所述的重组人纤连蛋白肽的核酸，并进行大肠偏好密码子优化，优化序列有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
4.根据权利要求1所述的核酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求3所述的核酸，其还包括用于蛋白纯化的His标签。
6.一种用于表达上述重组人纤连蛋白肽的载体，其特征在于为pET -28a、pET -20b或pQE -30。
7.一种宿主细胞，其包括权利要求6所述的表达载体，其特征在于为M15或BL21。
8.一种权利要求1或2所述的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）在宿主细胞中表达根据权利要求3或4或5所述的核酸；（2）收集和/或纯化所述重组人纤连蛋白肽。
权 利 要 求 书1/1页CN 110577592 A
一种重组人纤连蛋白肽
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及到基因工程领域，具体地说，涉及一种重组人纤连蛋白肽的制备方法。
背景技术
[0003]纤维连接蛋白（简称纤连蛋白）又称纤维结合蛋白、粘连蛋白、纤粘蛋白，英文名fibronectin，英文缩写Fn。纤维结合蛋白主要由肝脏及血管内皮细胞生成，广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，二聚体分子量约为450KD，具有多种生物活性。Fn 分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的Fn具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的Fn可以相互替代使用。纤连蛋白可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平，缩短细胞生长时间，提高杂交瘤技术中细胞融合率等。
[0004]然而现有的纤连蛋白由于分子量过大加工性较差，并且大多从动物组织中提取，是一种异源蛋白，具有一定的排斥反应，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构、特性、生物学功能与人类纤连蛋白极为相似的重组人纤连蛋白肽，不仅解决现有的纤连蛋白分子量过大，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了人纤连蛋白的优良生物学性能。
发明内容
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平的重组人纤连蛋白肽。[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组人纤连蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]在上述的重组人纤连蛋白肽中，其还包括用于蛋白纯化的His标签。
[0008]编码上述重组人纤连蛋白肽的核酸，并进行大肠偏好密码子优化，优化序列有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；优选为SEQ ID NO.2。其还包括用于蛋白纯化的His 标签。
[0009]一种用于表达上述重组人纤连蛋白肽的载体，为pET-28a、pET-20b或pQE-30。[0010]一种宿主细胞，其包括上述的表达载体，为M15或BL21(DE3)。
[0011]一种上述重组纤连蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）在宿主细胞中表达根据权利要求3或4或5所述的核酸；（2）收集和/或纯化所述重组人纤连蛋白肽。
[0012]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明截取纤连蛋白氨基酸序列第
12
~14区域，得到了分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性的重组纤连蛋白，可促进细胞生
长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平。本发明获得的重组纤连蛋白兼具纤连蛋白的特性，能使创伤面修复再生，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。
该重组纤连蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。同时也可以作为组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂。
附图说明
[0013]图1为大肠杆菌重组表达质粒pET20b-Fnp的构建图谱。
[0014]图2 为重组蛋白Fnp基因片段扩增。泳道1为DL2000DNAmarker；泳道2表示扩增的重组蛋白Fnp基因，约840bp；泳道3为阴性对照。
[0015]图3为含重组蛋白Fnp的SDS-PAGE分析。a.M：蛋白分子量标准，泳道1、3、5分别对应未诱导的BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-2、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-3表达系统；泳道2、4、6分别对应已诱导的BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1、BL21(DE3) / pET20b-Fnp-2、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-3表达系统（将使用序列SEQ ID NO: 2的表达菌命名为BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1，使用
序列SEQ ID NO:3的表达菌命名为BL21(DE3)/ pET20b-Fnp-2，使用序列SEQ ID NO:4的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3）。结果显示，BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1表达量均高于BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2和BL21(DE3)/ pET20b-Fnp-3的表达量。后面实验使用的序列默认为SEQ ID NO: 2。
[0016]图4为含重组蛋白Fnp纯化后样品的SDS-PAGE与Western blot分析。a. M：蛋白分子量标准，泳道1：Fnp纯化后样品；b： M：蛋白分子量标准，泳道1：Western blot鉴定Fnp。结果显示，纯化后的Fnp蛋白可见少部分二聚体。
[0017]图5为Fnp蛋白对HaCat细胞的促粘附作用。结果显示，市售牛纤连蛋白可提高
HaCat（ATCC No:CM-1252）细胞粘附率，本专利的Fnp在0.0781nmol/mL
~1.250 nmol/mL之间
的粘附作用优于市售牛纤连蛋白。
[0018]图6为Fnp蛋白对HaCat细胞的划痕愈合作用。结果显示给药24h后，与空白组相比，蛋白浓度为10nmol/mL的Fnp促细胞划痕愈合效果明显优于空白对照组和10nmol/mL的市售牛纤连蛋白。
[0019]图7 为CS-Glu/PEG-BA水凝胶中HUVEC细胞的形态和分布图。
[0020]培养时间：A) 6h；B) 72h ；C) 168h； D-F为A-C对应的图像。结果显示细胞培养72h和168h 后，本发明的Fnp（200ug/mL）促进HUVEC细胞粘附CS-Glu/PEG-BA水凝胶的效果明显优于空白对照组。
[0021]
具体实施方式
[0022]下面结合附图对本发明进一步说明，但是本领域技术人员应该理解本发明并不限于这些具体的实施例。
[0023]除非另外指明，下述实施例中所用的空质粒均为可商购获得的质粒。重组质粒采用常规分子克隆方法构建。
[0024]实施例1：重组人纤连蛋白肽在大肠杆菌中表达
1 构建重组表达人纤连蛋白肽的表达载体：
将编码重组人纤连蛋白肽的DNA片段(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4，将使用序列SEQ ID NO: 2的表达菌命名为BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1，使用序列SEQ ID NO:3的
表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2，使用序列SEQ ID NO:4的表达菌命名为BL21 (DE3)/pET20b-Fnp-3。BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2、BL21(DE3)/ pET20b-Fnp-3的诱导结果如图3所示，结果显示，BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1表达量均高于BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2和BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的表达量。后面实验使用的序列默认为SEQ ID NO: 2。)送到金唯智生物科技有限公司进行全基因合成，在所述Fnp核苷酸序列的5’端和3’端分别加入Nde1和Hind111(TAKARA Co.Ltd)酶切位点，利用Nde1和Hind111双酶切表达载体pET20b（Tiandz，货号60908-2782）并进行回收，将回收的片段与合成产物用T4 DNA连接酶连接以构建重组质粒pET-20b-Fnp。
[0025]2 重组人纤连蛋白肽的表达：
将表达空菌株BL21(DE3) (Invitrogen Co.Ltd)在LB固体培养平板上划线培养过夜。从平板培养基上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃摇床内200rpm培养过夜。次日以1％转接量接种到新鲜LB液体培养基中37℃摇床内200rpm培养2-3小时至OD600＝0.3-0.5。4℃，4000rpm 离心10min，弃上清。然后用冰预冷的0.1M CaCl 2 重悬菌体沉淀，冰浴 30min。4000rpm/min离心10min，弃上清，用冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体沉淀，同时加入终体积15％-20％的灭菌甘油，混匀后置于冰上。取出 0.1μg重组表达质粒pET20b-Fnp，加入到上述准备好的感受态细胞中，42℃热激法转化后培养过夜。利用PCR技术鉴定阳性重组子pET20b-Fnp。挑取阳性重组子接种到LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃、200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，1mM IPTG诱导4 小时，收集菌体，加入20mM的磷酸盐缓冲液
(pH7.0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心30分钟，收集上清。SDS-PAGE 检测和分析Fnp蛋白的表达，重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达，其分子量约为30kDa。
[0026]实施例2
将实施例1所得人工合成重组人纤连蛋白肽的基因序列（SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4），在5’端和3’端分别引入Nde I和Hind 111酶切位点，通过Nde I/ Hind 111双酶切将其连入pET20b载体，由此得到pET20b-Fnp重组质粒。将此重组质粒导入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中培养，以IPTG诱导表达Fnp蛋白，通过镍亲和层析得到纯化的蛋白，通过 SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白的分子量大小和免疫学验证，并检验其生物活性。具体步骤如下：
(1)pET20b-Fnp重组质粒构建与鉴定：本发明采用人工方法合成纤连蛋白基因肽序列，在5’端和3’端分别引入Nde I和Hind 111酶切位点。为方便后续纯化，在5’端起始密码之后加上组氨酸标签，通过Nde I/ Hind 111双酶切将其连入pET20b载体，得到pET20b-FN重组质粒并转化TOP10感受态细胞，在LB(Amp)培养基中挑选阳性克隆。以LB(Amp)平板的单克隆为模板，加入两端引物FnpF(SEQ ID NO.5)和FnpR(SEQ ID NO.6)，再加入Premix Taq™预混酶，按照 PCR反应条件（95℃ 变性10min后进入循环，循环参数第一步为95℃变性60秒，60℃退火30秒， 72℃延伸60秒，30个循环）进行目的片段的扩增。核酸电泳检测目的片段大小。结果如图2所示，获得了目标片段。
[0027](2)Fnp蛋白的表达：将基因表达载体转化如感受态细胞BL21(DE3)，并在LB(Amp)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，接种于LB(Amp)培养中，37℃培养3-5h至OD600为0.5时，加入 IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导培养约4h，离心收集菌体
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