[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101544995A [43]公开日2009年9月30日
[21]申请号200910098197.6[22]申请日2009.05.07
[21]申请号200910098197.6
[71]申请人杭州临安天鸿生物科技有限公司
地址311300浙江省临安市锦城镇大华路137号
汇锦创业大厦6楼
[72]发明人陈安良 陈张金 刑健彬 童云标 [74]专利代理机构杭州九洲专利事务所有限公司代理人王洪新
[51]Int.CI.C12P 11/00 (2006.01)C07C 331/20 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 9 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明属于生物化学技术领域。目的是提供一
种萝卜硫素的提取方法的改进，该提取方法优化了
原有提取纯化方法，提高了萝卜硫素的转化率，大
大降低了萝卜硫素的生产成本。一种萝卜硫素的提
取方法，包括以下步骤：1.用干燥的西兰花种子或
新鲜的西兰花球为原料，粉碎后，加入水，调节pH
4.1～4.5，加入粗芥子硫苷酸酶后，水解；2.将水
解后的西兰花冷冻干燥成粉末；3.在粉末中，加入
纯丙酮，浸提，过滤、合并丙酮浸提液，将滤液真
空浓缩成萝卜硫素粗品；4.该萝卜硫素粗品梯度洗
脱，收集馏分，真空浓缩；5.将萝卜硫素先用甲醇
溶解后，经微孔滤膜过滤后，用C18硅胶装柱，采
得萝卜硫素。
200910098197.6权 利 要 求 书第1/2页 1、一种萝卜硫素的提取方法，包括以下步骤：
(1)用干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球为原料，粉碎至30～60目后，按重量计加入1.5～2倍量的水，用5％盐酸调节pH4.1～4.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶后，在31～34℃的温度下水解1～3h；
(2)将水解后的西兰花固液混合物冷冻干燥成含水率小于5％的粉末；
(3)冷冻干燥后的粉末中，分3次共加入10倍重量的纯丙酮，在室温下共浸提4～8h，过滤、合并3次制备得到的丙酮浸提液，将滤液于35～40℃温度下真空浓缩得到萝卜硫素粗品；
(4)将上述制备得到的萝卜硫素粗品采用硅胶柱层析，采用乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，35～40℃温度下真空浓缩；
(5)将上述经真空浓缩的萝卜硫素先用甲醇溶解后，经0.2μm微孔滤膜过滤后，用20～40μm的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，35～40℃温度下真空干燥，得到高含量的萝卜硫素。
2、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于所述的粗芥子硫苷酸酶为芥子硫苷酸酶的粗品，其制备方法是：取新鲜甘蓝，粉碎至30～60目，用50目的双层纱布过滤后得滤液，滤液在5℃温度下加入1倍量滤液体积的纯丙酮，混合均匀，在高速冷冻离心机下离心，离心机转速为4000r/min，离心时的温度为4～6℃；得沉淀物，即为芥子硫苷酸酶的粗品，将该芥子硫苷酸酶的粗品放入-20℃下进行冷冻保存、备用。
3、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于所述萝卜硫素粗品硅胶柱层析前，需要先
在萝卜硫素粗品中加入200目的硅胶拌样，硅胶的加入量为萝卜硫素粗品重量的两倍，经硅胶拌样后的萝卜硫素粗品在红外灯下烘干直至丙酮完全挥发即可。
4、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(4)中
200910098197.6权 利 要 求 书 第2/2页梯度洗脱前需要先加入3倍柱体积量的乙酸乙酯进行洗脱除杂。
5、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(4)中用于梯度洗脱的洗脱剂为：乙酸乙酯与乙醇的混合溶液，该混合溶液中乙酸乙酯与乙醇的体积比为1～3：9～7。
6、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱的操作需要进行三次，三次梯度洗脱时乙酸乙酯与乙醇的体积比分别为1：9，2：8，3：7。
7、如权利要求1所述的一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于步骤(5)中所述的洗脱剂是浓度为60～80％的甲醇。
200910098197.6说 明 书第1/9页
一种萝卜硫素的提取方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及天然产物中有效成分的提取纯化工艺，具体为一种从干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球中提取萝卜硫素的方法。背景技术
目前，根据流行病学及药理学的研究表明，癌症发病率低的地方，人们饮食中蔬菜、水果所占比例较大。蔬菜、水果中存在一种或多种阻止或减慢癌症发展的植物活性成分，如番茄中的番茄红素、大豆制品中的大豆异黄酮、浆果中的鞣化酸以及十字花科蔬菜中的萝卜硫素、吲哚类物质，均被证实具有良好的防癌抗癌作用。
在众多含有抗癌活性成分的蔬菜中，十字花科(洋白菜、花茎甘蓝、球茎甘蓝青花椰菜、芥兰、莴苣、白萝卜和高丽菜等)中富含多种芥子苷(glucosinolates，简称GLs)。葡萄糖莱菔子苷(芥子苷的一种)经黑芥子硫酸苷酶酶解(myrosinase)或酸水解后，产生萝卜硫素(sulforaphen，简称SF)，它是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌成分之一。萝卜硫素又称“莱菔子素”，就其化学成分而言，为异硫代氰酸盐衍生物，易溶于水，相对分子质量177.3，分子式C6H11S2NO，结构式如下：
萝卜硫素是一种多功能诱导物，可诱导机体产生I I型解毒酶——谷光甘肽转移酶和醌还原酶，此酶可对许多致癌物产生抗性，从而起到抗癌作用。萝卜硫素具有较强的抗癌作用且为植物活性物质，无毒副作用，所以具有广阔的市场
200910098197.6说 明 书 第2/9页前景。
目前，有研究报道从西兰花中提取萝卜硫素的方法，如专利为“一种提取萝卜硫素的方法(CN101143842)”，“一种莱菔硫烷的制备方法(CN1982294)”均涉及萝卜硫素的提取和纯化方法，但这两种方法制备得到的萝卜硫素的转化率较低，只限于实验规模制备少量产品，难于大规模地进行工业化的生产。 目前，还没有解决上述问题更好的实施方法。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的不足，提供一种萝卜硫素的提取方法的改进，该提取方法优化了原有提取纯化方法，提高了萝卜硫素的转化率，大大降低了萝卜硫素的生产成本。
本发明的技术方案：一种萝卜硫素的提取方法，包括以下步骤： (1)用干燥的西兰花种子或新鲜的西兰花球为原料，粉碎至30～60目后，按重量计加入1.5～2倍量的水，用5％盐酸调节pH4.1～4.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶后，在31～34℃的温度下水解1～3h；
(2)将水解后的西兰花固液混合物冷冻干燥成含水率小于5％的粉末；
(3)冷冻干燥后的粉末中，分3次共加入10倍重量的纯丙酮，在室温下共浸提4～8h，过滤、合并3次制备得到的丙酮浸提液，将滤液于35～40℃温度下真空浓缩得到萝卜硫素粗品；
(4)将上述制备得到的萝卜硫素粗品采用硅胶柱层析，采用乙酸乙酯和乙醇的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，35～40℃温度下真空浓缩；
(5)将上述经真空浓缩的萝卜硫素先用甲醇溶解后，经0.2μm微孔滤膜过滤后，用20～40μm的C18硅胶装柱，采用不同浓度的甲醇水进行梯度
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