[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101381697A [43]公开日2009年3月11日
[21]申请号200810155131.1[22]申请日2008.10.23
[21]申请号200810155131.1
[71]申请人江南大学
地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南
大学生物工程学院
[72]发明人饶志明 马正 杨套伟 诸葛斌 方慧英
诸葛健 [74]专利代理机构无锡市大为专利商标事务所代理人时旭丹 刘品超[51]Int.CI.C12N 1/21 (2006.01)C12N 15/53 (2006.01)C12N 15/74 (2006.01)
C12P 7/18 (2006.01)
C12R 1/22 (2006.01)
权利要求书 3 页 说明书 8 页 附图 6 页
[54]发明名称
[57]摘要
利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷
伯氏菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明
提供一株提高1，3－丙二醇产量的重组克雷伯氏杆
菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.) pETPkan－dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中
心，保藏编号为CCTCC NO：M 208134。将来自克雷
伯氏杆菌1，3－丙二醇氧化还原酶的基因dhaT，构
建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan－dhaT；将该表
达载体转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏
杆菌pETPkan－dhaT；加强dhaT基因的表达，得到
的重组克雷伯氏菌在以甘油为底物的发酵过程中，
中间产物3－羟基丙醛积累量明显降低，1，3－丙
二醇产量比对照提高16.9％；为构建高产1，3－丙
二醇或利用葡萄糖为底物产1，3－丙二醇克雷伯氏
基因工程菌打下基础。
200810155131.1权 利 要 求 书第1/3页 1、一株提高1，3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208134。
2、根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是构建所用的表达载体pETPkan-dhaT，采用卡那霉素抗性基因启动子Pkan。
3、根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是扩增了来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT。
4、根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是达到克雷伯氏杆菌自身的1，3-丙二醇氧化还原酶加强表达，来提高发酵法生产1，3-丙二醇的产量。
5、权利要求1所述重组克雷伯氏杆菌的构建方法，其特征是将来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因d h a T，构建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan-dhaT；将该表达载体pETPkan-dhaT转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT；
(1)质粒pETPkan的构建：
以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下：
P1:5’-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3’
P2：5’-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P1和P2各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；P C R条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃1分钟、72℃延伸2分钟，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR 片段回收试剂盒回收0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段经Bgl II和EcoR I 双酶切，用P C R片段回收试剂盒回收；载体p E T28a经过B a m H I和E c o R I双酶切，用P C R片段回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌J M109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/m L卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用Bgl II和EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的L B中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan，阳性重组子命名为JM109/pETPkan；
(2)质粒pETPkan-CMcds的构建：
以质粒p A C Y C D u e t为模板进行P C R扩增氯霉素编码结构基因C M c d s，所用引物如下：
P3：5’-cgc gaa ttc ATGGAG AAA AAA ATC ACT GG-3’
P4：5’-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P3和P4各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；P C R条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃ 1分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
用试剂盒回收0.7k b的目标片段；纯化好的目标片段经E co R I和H in d I I I 双酶切，回收；同时提取质粒pETPkan，并用EcoR I和Hind III双酶切，回收纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌J M109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/m L卡那霉素和25μg/m L氯霉素的L B琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的L B中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-CMcds，阳性重组子命名为
JM109/pETPkan-CMcds；
(3)质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌：
质粒p E T P k a n-C M c d s用氯化钙法转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/m L卡那霉素和25μg/m L氯霉素的L B琼脂平板，37℃培养过夜；发现有大量单菌落生成；
(4)质粒pETPkan-dhaT的构建：
以克雷伯氏菌染体D N A为模板，进行P C R扩增1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因dhaT，引物序列如下：
P5：5’-ACCGGAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P6：5’-ACC GAAGCTTTC AGA ATG CCT GGC G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P5和P6各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；P C R条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃1.5分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR 片段回收试剂盒回收1.2kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III 双酶切，用P C R片段回收试剂盒回收；载体p E T P
k a n经过E c o R I和H i n d I I I双酶切，用P C R片段回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌J M109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/m L卡那霉素的L B琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用E c o R I和H i n d I I I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的L B中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为p E T P k a n-d h a T，阳性重组子命名为
JM109/pETPkan-dhaT；
(5)重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT的构建：
取一支冷冻保存的J M109/p E T P k a n-d h a T，接种于20m L含50μg/m L卡那霉素的L B培养基中，37℃培养过夜，提取质粒p E T P k a n-d h a T，用氯化钙法转化克雷伯氏杆菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/m L卡那霉素L B琼脂平板，37℃培养过夜；有大量单菌落生成，即为重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT。
6、用权利要求1所述重组克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征是：
出发菌株：重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT；
培养基组成：种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10； 发酵培养基以g/L计：甘油50，
酵母膏5，KH2PO4 5，(NH4)2SO4 0.1，柠檬酸4，微量元素溶液60m L，维生素B12的添加量为发酵培养基中维生素B12终浓度15mg/L，初始pH7.0；
所述微量元素溶液每升含有：0.68g ZnCl2，2.0g MnCl2·4H2O，60mg H3BO3，0.47g CoCl2·6H2O，5mg Na2MoO4·2H2O，17g CuCl2·2H2O，5.4g FeCl3·6H2O和质量浓度37％的HCl 10mL；
培养条件：从新鲜的L B培养基斜面上挑取一环菌株接入装液量为50m L 的250m L摇瓶中，于旋转式摇床中37℃、140r/m i n培养20h得到种子液，按照5％接种量接入装液量为50m L发酵培养基的250m L摇瓶中，发酵30h。
200810155131.1说 明 书第1/8页利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用
技术领域
利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用，涉及卡那霉素抗性基因启动子在提高克雷伯氏菌1，3-丙二醇产量中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，作为医药和有机合成的中间体用于
食品、化妆品和制药等行业，1，3-丙二醇最重要的用途就是作为合成新型聚酯如聚对苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(PTT)的单体，因而1，3-PD 在纺织、地毯以及工程塑料领域也具有非常广阔的应用前景。1，3-丙二醇生产主要采用化学方法，但因环境污染、石油资源紧张等，使其进一步发展受到限制。欧美国家积极开展用肠道细菌和梭状芽孢将甘油转化为1，3-PD的研究，Dupont 公司开发的由葡萄糖合成1，3-PD，进而合成PTT的工艺，被授予2003年美国总统绿化学奖。
目前，应用自然菌株发酵生产1，3-丙二醇得到了广泛的关注，其能以甘油作为唯一的碳源和能源发酵生产1，3-PD。自然菌株主要集中在克雷伯氏杆菌属、弗氏柠檬杆菌属和梭状芽孢杆菌属。人们对克雷伯氏菌研究较早，对其代谢途径认识比较清楚，有研究表明，克雷伯氏菌以甘油为底物生产1，3-PD，经过以下两步反应，即甘油在甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成中间产物3-羟基丙醛；3-羟基丙醛在1，3-丙二醇氧化还原酶(P D O R)的催化下生成1，3-P D。 从目前研究的现状看，克雷伯氏杆菌(Klebsiella.sp)发酵甘油的底物转化率、产物浓度和生产强度都比较高，因此是一种有希望实现工业化的方法。然而相比化学法合成1，3-PD的价格，微生物发酵法目前没有明显的成本优势，其主要的原因是发酵液中产品的浓度和发酵强度低，从而使生产成本相对较高，为取得更大的经济效益尚存障碍，因此，为进一步降低生产成本，开发提高1，3-PD 发酵液中产品浓度及生产强度的克雷伯氏基因工程菌成为研究的重点。如利用分子生物学技术将甘油合成1，3-PD关键酶基因转入克雷伯氏菌内，增强甘油合成1，3-PD代谢流通量，从而提高克雷伯氏菌的生产强度；或将葡萄糖合成甘油关键酶基因导入克雷伯
氏菌中，扩大克雷伯氏菌的底物利用范围，即能以廉价的碳水化合物如葡萄糖为底物直接生产1，3-PD，以降低生产成本，提高产品的竞争力。
然而，构建一种高效的表达系统是利用途径工程改造克雷伯氏菌的前提和
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议