(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011435733.X
(22)申请日 2020.12.11
(83)生物保藏信息
CCTCC M 2020648 2020.10.28
(71)申请人 中国科学院上海高等研究院
地址 201210 上海市浦东新区海科路99号
(72)发明人 郝健
(74)专利代理机构 上海硕力知识产权代理事务
所(普通合伙) 31251
代理人 杨用玲
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12P 7/18(2006.01)
C12P 7/58(2006.01)
C12P 7/26(2006.01)
C12P 7/40(2006.01)C12P 7/42(2006.01)C12R 1/22(2006.01) (54)发明名称
一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp ）菌株及 (57)摘要
本发明公开了一种克雷伯氏菌
（Klebsiella.spp ）菌株及工程菌和应用。所述菌
株命名为克雷伯氏菌SARI K01，保藏在中国典型
保藏日期为2020年10月28日，
保藏编号为CCTCC M 2020648。该菌进行液体培养时，很大一部分菌
体自然聚集形成絮状结构；将发酵液静置后，菌
体絮状结构很快沉降。该菌和以该菌为出发菌株
3‑丁二醇、乙偶姻、2‑酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、
木糖酸、2‑酮基异戊酸、异丁醇、2,3‑二羟基异戊
酸等化学品。利用本发明提供的菌株或其工程菌
株，具有菌体容易从发酵液中分离、菌体生长快、
产物浓度高、产物生产速率高、底物转化率高等
优点，
具有很好的应用价值和经济效益。权利要求书2页 说明书8页CN 112226399 A 2021.01.15
C N 112226399
A
1.一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）菌株，其特征在于：该菌株命名为克雷伯氏菌SARI K01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2020年10月28日，保藏编号为CCTCC M 2020648。
2.权利要求1所述的克雷伯氏菌菌株构建的工程菌，其特征在于：所述工程菌通过以下至少其一的方式进行构建，
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丁二醇脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的葡萄糖酸脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乳酸脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙醇脱氢酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丙酮酸脱氢酶复合物构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丙酮酸脱羧酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丁二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合物；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶。
3.权利要求1所述的克雷伯氏菌菌株或权利要求2所述的工程菌或利用权利要求1所述克雷伯氏菌菌株的遗传资源构建的工程菌在生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、木糖酸、2-酮基异戊酸、异丁醇或2,3-二羟基异戊酸至少其一种化学品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产所述化学品。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌在液体培养中能够通过细胞聚集形成絮状物。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产1,3-丙二醇，其中培养基以甘油为主要碳源。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产2,3-丁二醇、乙偶姻或2-酮基葡萄糖酸，其中培养基以葡萄糖为主要碳源。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产木糖酸，其中培养基以木糖为主要碳源。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述工程菌生产2-酮基异戊酸和/或异丁醇；所述工程菌为失活克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶，或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述工程菌生产葡萄糖酸，其中培养基以葡萄糖为主要碳源，所述工程菌为失活克雷伯氏菌SARI K01的葡萄糖酸脱氢酶。
11.如权利要求3所述的应用，其特征在于：通过液体发酵培养所述工程菌生产2,3-二羟基异戊酸，所述工程菌为同时失活克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶。
一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）菌株及工程菌和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）菌株及其构建的工程菌和应用。
背景技术
[0002]克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）属于肠杆菌科，克雷伯氏菌在自然界广泛分布，天然存在于土壤、水体、植物根际、动物粘膜等环境。克雷伯氏菌对环境中的生物化学和地球化学过程具有重要作用，是微生态落中主要的成员。
[0003]克雷伯氏菌在农业中有广泛的应用。克雷伯氏菌是一类植物的根际共生菌，可以固氮促进植物的生长。同时还具有溶解土壤中磷的能力，对共生植物的生长具有明显的促进作用。克雷伯氏菌可以拮抗烟草黑胫病菌，防治烟草黑胫病。克雷伯氏菌可以作为生物杀虫剂，用于杀美国白蛾。
[0004]克雷伯氏菌在环境治理中有广泛的应用。克雷伯氏菌可以降解环境中污染的硫氰酸盐。克雷伯氏菌可以还原环境中六价铬离子，处理环境污染。菌体可以吸收水体中的二价镉，清除污染。克雷伯氏菌用于菌剂可以降解土壤中吡啶，污水中的苯酚。克雷伯氏菌可以对偶氮染料进行脱，应用于印染废水及污染土壤的处理。克雷伯氏菌可生产生物絮凝剂，用于污水处理。
[0005]克雷伯氏菌的遗传资源有广泛的应用。雷伯氏菌可用于单宁酸酶、β-半乳糖苷酶生产。克雷伯氏菌的漆酶基因可以外源表达，获得的漆酶用于偶氮类和蒽醌类染料脱。将克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶进行外源表达，获得赖氨酸脱羧酶多肽可用于戊二胺生产。[0006]克雷伯氏菌在食品中的应用。克雷伯氏菌可以作为食品发酵用菌来改善食品的品质，该菌具有合成VB12的能力，在蓝纹奶酪制作中添加该菌株，增加了奶酪中VB12、叶酸和铁的含量。
[0007]克雷伯氏菌在化学品中的应用。克雷伯氏菌可作为生产用菌来生产2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、木糖酸、2-酮基葡萄糖酸、2,3-二羟基异戊酸、异丁醇、1,3-丙二醇等化学品。具有生长快，原料转化率高等特点。
[0008]一般在细菌液体培养过程中，细菌细胞处于游离悬浮状态。通过在培养液中添加絮凝剂可以对细胞进行絮凝，从而实现细胞和培养液进行分离的目的。有一些微生物具有自絮凝特点，自絮凝是微生物在液体培养中细胞自发聚集形成聚集体。自絮凝特征的微生物容易实现与培养液的分离，从而降低产物分离提取成本。
发明内容
[0009]本发明的目的是，提供一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）菌株及其构建的工程菌和应用。
[0010]本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种克雷伯氏菌（Klebsiella. spp）菌株，该菌株命名为克雷伯氏菌SARI K01，保藏在
中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2020年10月28日，保藏编号为CCTCC M 2020648。
[0011]本发明还提供由克雷伯氏菌SARI K01构建的工程菌，该工程菌通过以下至少其一的方式进行构建，
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丁二醇脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的葡萄糖酸脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乳酸脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙醇脱氢酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丙酮酸脱氢酶复合物构建工程菌；
失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丙酮酸脱羧酶构建工程菌；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的丁二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合物；
同时失活所述克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶。
[0012]本发明还提供克雷伯氏菌SARI K01以及由其构建的工程菌或利用其遗传资源构建的工程菌在生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、木糖酸、2-酮基异戊酸、异丁醇或2,3-二羟基异戊酸至少其一种化学品中的应用。
[0013]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产所述化学品。所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌在液体培养中能够通过细胞聚集形成絮状物。
[0014]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产1, 3-丙二醇，其中培养基以甘油为主要碳源。
[0015]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产2, 3-丁二醇、乙偶姻或2-酮基葡萄糖酸，其中培养基以葡萄糖为主要碳源。
[0016]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌SARI K01或工程菌生产木糖酸，其中培养基以木糖为主要碳源。
[0017]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述工程菌生产2-酮基异戊酸和/或异丁醇；所述工程菌为失活克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶，或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶。
[0018]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述工程菌生产葡萄糖酸，其中培养基以葡萄糖为主要碳源，所述工程菌为失活克雷伯氏菌SARI K01的葡萄糖酸脱氢酶。
[0019]作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述工程菌生产2,3-二羟基异戊酸，所述工程菌为同时失活克雷伯氏菌SARI K01的乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶。
[0020]相对于现有技术，本发明的有益效果为：
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