(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811021770.9
(22)申请日 2018.09.03
(71)申请人 江苏高航农业科技有限公司
地址 222002 江苏省连云港市高新区花果
山大道17号楼108室
(72)发明人 邱振东
(74)专利代理机构 长沙新裕知识产权代理有限
公司 43210
代理人 赵登高
(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
A01H 1/08(2006.01)
(54)发明名称
方法
(57)摘要
本发明公开了一种高丛蓝莓花药培养获得
单倍体植株的方法，属于生物技术和农业科学领
域。本发明的技术路线包括以下步骤：
（1）新鲜花蕾的选取；（2）无菌花药的获得与接种；（3）花药
辐射处理；（4）花药诱导培养；（5）愈伤组织分化
培养；（6）健苗生根培养。本发明首次通过花药离
体培养得到了高丛蓝莓单倍体植株，为进一步开
展蓝莓的单倍体育种和相关理论研究提供了技
术基础和实验材料。权利要求书2页 说明书6页CN 109122319 A 2019.01.04
C N 109122319
A
1.一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）新鲜花蕾的选取
在蓝莓盛花期于晴天上午9:00-11:00取材，采集健壮植株上的花蕾，用湿纱布包裹放入密封容器中带回实验室，筛选出小孢子处于单核中晚期的花蕾；
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花蕾先用洗洁精清洗干净，在自来水下冲洗10-20min；然后置于超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s，再用0.1%溶液消毒10-15min，边消毒边摇晃；倒去溶液后，用无菌水冲洗4-5次；用解剖针剥将花药完整剥离取出，切去花丝，接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种30-40个花药；
所述诱导培养基的配方为：K 2SO 4 740~880mg/L，NH 4NO 3 533~595mg/L，MgSO 4·7H 2O 406~438mg/L，KH 2PO 4 104~122mg/L，Ca(H 2PO 4)2·H 2O 487~503mg/L，MnSO 4·4H 2O 21~22mg/L，ZnSO 4·7H 2O 5.2~5.8mg/L，H 3BO 3 6.3~6.5mg/L， Na 2MoO 4·2H 2O 0.21~0.23m
g/L，CoCl 2·6H 2O 0.023~0.025mg/L，CuSO 4·5H 2O 0.18~0.22mg/L，Fe -Na 2EDTA 32.8~34.4mg/L，肌醇107~115mg/L，烟酸1.2~1.6mg/L，甘氨酸1.7~2.5 mg/L，脯氨酸4.4~5.0 mg/L，牛肉浸膏24~30mg/L，盐酸硫胺素0.7~0.9mg/L，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/L，泛酸1.1~1.3mg/L，2-氨基嘌呤0.37~0.41mg/L，丁酰肼0.03~0.05mg/L，水溶性碳纳米管53~63mg/L，四甲基戊二酸0.6~1.0mg/L，番茄汁26~32mL/L，芸苔素内酯0.1~0.3mg/L，海藻提取液42~50mL/L，蔗糖11~15g/L，葡萄糖7~11g/L，黄原胶3~5g/L，pH值为5.0~5.4；
（3）花药辐射处理
将上述花药先置于28-30℃黑暗条件下培养3d，再用60Co -γ射线进行照射，得到辐射处理后的花药；
（4）花药诱导培养
将辐射处理后的花药置于温度24-26℃、光照强度600-800Lx、光照时间5-7h/d的培养条件下培养35-45d，花药可形成愈伤组织；
（5）愈伤组织分化培养
当愈伤组织大小长至2-3mm 时，及时转移至分化培养基上，培养14-21d后愈伤组织开始转绿，之后每20d左右继代1次，继代2次后愈伤组织分化出不定芽；培养条件控制为温度24-26℃，光照强度1000-15
00Lx，光照时间10-12h/d；
（6）健苗生根培养
待步骤（5）中的不定芽长成1-2 cm高的芽苗时，将芽苗剪切成单苗，竖接于生根培养液中，使其基部与培养液接触，培养24-33d可形成根系发育旺盛的完整植株；培养条件控制为温度23-27℃、光照强度2000-2500 Lx，光照时间14-18h/d。
2.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（1）中筛选花蕾的方法为镜检法，具体操作方法为先将采集的花蕾进行标记，然后挑取花蕾中的花药2~4枚，置于载玻片上碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染后压片，将载玻片置于显微镜下观察花粉发育时期，筛选出花粉小孢子处于单核靠边期的花蕾。
3.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述步骤（3）中60Co -γ射线的照射剂量为100 R 、剂量率为25.6 R/min。
4.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，
所述步骤（2）中诱导培养基的最优配方为：K2SO4 800mg/L，NH4NO3 564mg/L，MgSO4·7H2O 422mg/L，KH2PO4 113mg/L，Ca(H2PO4)2·H2O 495mg/L，MnSO4·4H2O 21.5mg/L，ZnSO4·7H2O
5.5mg/L，H3BO3 6.4mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.22mg/L，CoCl2·6H2O 0.024mg/L，CuSO4·5H2O 0.20mg/L，Fe-Na2EDTA 33.6mg/L，K2Cr2O7 0.019mg/L，肌醇111mg/L，烟酸1.4mg/L，甘氨酸2.1 mg/L，脯氨酸4.7mg/L，牛肉浸膏27mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，泛酸1.2mg/L，2-氨基嘌呤0.39mg/L，丁酰肼0.04mg/L，水溶性碳纳米管58mg/L，四甲基戊二酸0.8mg/L，番茄汁29mL/L，芸苔素内酯0.2mg/L，海藻提取液46mL/L，蔗糖13g/L，葡萄糖9g/L，黄原胶4g/L，pH值为5.2。
5.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，
所述步骤（5）中分化培养基的配方为：WPM+脯氨酸9.5
~10.5mg/L+2-氨基嘌呤0.33
~
0.39mg/
L+TIBA(2,3,5-三碘苯甲酸)0.5
~0.7mg/L+复硝酚钠0.15
~
0.20 mg/L+甘露醇22
~
27g/L+番
茄汁39
~45mL/L+活性炭0.4
~
0.6 g/L，pH值为5.0
~
5.4。
6.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，
所述步骤（5）中生根培养液的配方为：1/2WPM（不添加琼脂和蔗糖）+聚蔗糖23
~30g/L+微囊
藻素30
~37mg/L+4-碘苯氧乙酸 0.4
~
0.6mg/L+环己酮酸钙0.3
~
0.5mg/L+硅藻土0.32
~
0.38g/L+苹果汁36
~44mL/L+丙三醇13.5
~
15.5mg/L，pH值为5.0
~
5.4。
7.根据权利要求1所述的一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，所述诱导培养基配方中的海藻提取液为青岛蓝贝力海藻工业有限公司生产的产品。
一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，属于生物技术和农业科学领域。
背景技术
[0002]蓝莓（Vaccinium Spp）又名笃斯，为杜鹃花科越桔属多年生灌木，因果实呈蓝，故称为蓝莓。野生蓝莓原产于北美洲，广泛分布于北半球，在我国主要分布在长白山区、大小兴安岭以及西南山区，长江流域有少量分布。现在市场上的蓝莓均为人工培育的栽培品种，其中以美国产的蓝莓品质最优。蓝
莓果味酸甜，果实上有一层白果粉，果肉细腻，甜酸适口，风味独特，营养丰富，被誉为“浆果之王”。研究表明，蓝莓具有很高的营养价值和保健功能。蓝莓鲜果富含蛋白质、不饱和脂肪酸、纤维素、维生素、微量元素和有机酸，能为人体提供丰富的营养元素。蓝莓果中还含有多种生物活性物质，例如花素苷、类黄酮化合物等，其中花素苷具有活化和促进视红素的再合成、抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗氧化防衰老、抗癌等多种生理保健功能，因此，联合国粮农组织将蓝莓列为人类五大健康食品之一。此外蓝莓果实可以直接加工成果酱、果冻、果糕和饼馅等，蓝莓提取物可以作为天然素、保健食品、高级化妆品的原料，因此蓝莓也被誉为21世纪前叶最具有发展潜力的果树树种。
[0003]当前栽培的蓝莓品种主要有高丛蓝莓、低丛蓝莓和兔眼蓝莓3大类，其中高丛蓝莓又分为南高丛蓝莓、北高丛蓝莓及半高型高丛蓝莓3种。高丛蓝莓具有果实大、含糖量高、果深、鲜食风味佳的优点，深受人们的喜爱。在国际市场上，蓝莓鲜果的售价居高不下，并且供不应求；蓝莓在食品加工和工业用途等方面也具较好的发展前景，因此发展蓝莓产业能带来极大的经济效益。
[0004]我国的蓝莓产业尚处于起步阶段，目前全国栽培的品种均引自欧美、日本等国，尚无具有自主知识产权的当家品种。然而我国具有较丰富的野生蓝莓资源，这些野生品种虽然产量低，但往往具有抗旱、抗寒、抗病等优良特性，可以用来改良现有的栽培品种，从而培育出适应我国气候环境、长势较为强健的优质高产品种，必将有力推动我国蓝莓的品种创制和长远发展。
[0005]常规杂交育种是蓝莓育种的主要方式，但其纯化材料周期长、见效慢，不能切实的满足生产上对优良品种的迫切需求。单倍体育种是现代生物技术育种手段之一，在育种上可以利用F1代杂交种花药、花粉或未受精的子房，通过离体培养获得单倍体材料经染体加倍产生双单倍体，双单倍体（DH）具有完全纯合同质的特性并且是标准的自交系，因此通过单倍体育种不仅可以克服性状的分离缩短育种年限，而且可以快速培育自交系，从而大大加快育种的进程。
[0006]花药离体培养是人工诱导单倍体的最常用手段，也是单倍体育种的物质基础。然而目前国内关于诱导蓝莓花药获得单倍体的专利还未见报道，相关的文献也很少，这说明蓝莓花药培养在实践过程中仍然存在诸多问题。花药培养能否成功在很大程度上依赖于物
种基因型，表现为在离体培养过程中出现不同的愈伤组织诱导率、分化率、再生植株诱导率等。另一方面，除基因型外，花药培养还要受到预处理方式、培养基微环境、离体培养大环境等一系列外部因素的影响，这些影响因子彼此之间相对独立，因此只有在所有影响因子都处于合适范围内，才有可能获得成功。本研究团队以高丛蓝莓为材料，对花药培养的一些典型影响因素做了一系列的研究，初步建立了蓝莓花药培养再生体系，并获得了蓝莓再生单倍体植株，为以后蓝莓单倍体育种提供了纯系材料和储备技术。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，可以有效的在短期内获得高丛蓝莓单倍体植株，后期再通过染体加倍即可获得纯系DH植株，为高丛蓝莓的品种改良和新品种培育提供亲本材料。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高丛蓝莓花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）新鲜花蕾的选取
在蓝莓盛花期于晴天上午9:00-11:00取材，采集健壮植株上的花蕾，用湿纱布包裹放入密封容器中带回实验室，筛选出小孢子处于单核中晚期的花蕾；
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花蕾先用洗洁精清洗干净，在自来水下冲洗10-20min；然后置于超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s，再用0.1%溶液消毒10-15min，边消毒边摇晃；倒去溶液后，用无菌水冲洗4-5次；用解剖针剥将花药完整剥离取出，切去花丝，接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种30-40个花药；
所述诱导培养基的配方为：K 2SO 4 740~880mg/L，NH 4NO 3 533~595mg/L，MgSO 4·7H 2O 406
~438mg/L，
KH 2PO 4 104~122mg/L，Ca(H 2PO 4)2·H 2O 487~503mg/L，MnSO 4·4H 2O 21~22mg/L，ZnSO 4·7H 2O 5.2~5.8mg/L，H 3BO 3 6.3~6.5mg/L， Na 2MoO 4·2H 2O 0.21~0.23mg/L，CoCl 2·6H 2O 0.023~0.025mg/L，CuSO 4·5H 2O 0.18~0.22mg/L，Fe -Na 2EDTA 32.8~34.4mg/L，肌醇107~115mg/L，烟酸1.2~1.6mg/L，甘氨酸1.7~2.5 mg/L，脯氨酸4.4~5.0 mg/L，牛肉浸膏24~30mg/L，盐酸硫胺素0.7~0.9mg/L，盐酸吡哆醇0.4~0.6mg/L，泛酸1.1~1.3mg/L，2-氨基嘌呤0.37~0.41mg/L，丁酰肼0.03~0.05mg/L，水溶性碳纳米管53~63mg/L，四甲基戊二酸0.6~1.0mg/L，番茄汁26~32mL/L，芸苔素内酯0.1~0.3mg/L，海藻提取液42~50mL/L，蔗糖11~15g/L，葡萄糖7~11g/L，黄原胶3~5g/L，pH值为5.0~5.4；
（3）花药辐射处理
将上述花药先置于28-30℃黑暗条件下培养3d，再用60Co -γ射线进行照射，得到辐射处理后的花药；
（4）花药诱导培养
将辐射处理后的花药置于温度24-26℃、光照强度600-800Lx、光照时间5-7h/d的培养条件下培养35-45d，花药可形成愈伤组织；
（5）愈伤组织分化培养
当愈伤组织大小长至2-3mm 时，及时转移至分化培养基上，培养14-21d后愈伤组织开始转绿，之后每20d左右继代1次，继代2次后愈伤组织分化出不定芽；培养条件控制为温度
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