(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810042317.X
(22)申请日 2018.01.17
(71)申请人 吉林省农业科学院
地址 130033 吉林省长春市净月高新开发
区生态大街1363号
(72)发明人 王云鹏 李海云 刘新凤 邢少辰
韦正乙 范杰英
(74)专利代理机构 北京卓岚智财知识产权代理
事务所(特殊普通合伙)
11624
代理人 任漱晨
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/82(2018.01)A01H 6/46(2018.01)A01G 7/06(2006.01)
(54)发明名称抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达及鉴定表达后的抗性方法(57)摘要本发明公开了抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达及鉴定表达后的抗性方法，表达方法包括以下步骤：步骤(1)、载体构建；步骤(2)、烟草叶绿体转化和同质化筛选；步骤(3)、分子检测。在烟草叶绿体中表达抗菌肽MSI-99基因，提取转基因烟草叶片中的粗蛋白，分析其对不同来源的稻瘟病分离物的菌丝体生长是否具有抑制作用，表明烟草叶绿体来源的MSI-99对多个稻瘟病生理小种具有明显的抑制作用，为培育叶绿体转基因水稻抗稻瘟病新品种以及新型生物农药的研制奠定基础。本发明除了在烟草中高效表达了MSI-99，同时首次发现了其对稻瘟病两种病原菌提取物的有效抗性。这在提高生物农药适应性和 延长有效性方面均有益处。权利要求书1页 说明书16页 附图6页CN 108148857 A 2018.06.12
C N 108148857
A
1.一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、载体构建；
步骤(2)、烟草叶绿体转化和同质化筛选；
步骤(3)、分子检测。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，步骤
(1)中载体构建包括：MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化；载体pWYP21451的构建，线性化载体的准备；插入片段的准备；重组载体的无缝连接。
3.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，MSI99基因、aadA基因和gfp基因的密码子优化的具体方法为：WORKS3.0及Synthetic Gene Designer将MSI99基因、aadA基因、GFP基因在不改变其编码的氨基酸序列的情况下，进行密码子优化工作，并将经过优化后的核苷酸序列进行分析，依次记录其GC含量及分布性、CAI 值、最适密码子使用频率、重复序列结构域。
4.根据权利要求3所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化之后，将优化的3个基因序列依次置于烟草Prrn启动子和Trps16终止子之间，并在每个基因前添加核糖体结合位点，MSI99基因与Prrn 启动子紧密相连，且在GFP基因和aadA基因两端添加位点特异性重组位点attP和attB序列。
5.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述线性化载体的准
备方法：取质粒pEASY-Nt，用Nsi I酶切，酶切体系37℃反应2h，回收酶切产物，获得载体片段。
6.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述插入片段的准备方法：将获得的表达框片段无缝连接到线性化的载体片段上，提取质粒pEASY-synth，进行PCR扩展目的片段，所获得的PCR产物经PCR回收试剂盒回收，即为插入片段。
7.根据权利要求2所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述重组载体的无缝连接方法：将获得的载体片段和插入片段建立连接体系，将重组的混合液体转化大肠杆菌感受态细胞Mach1，涂于含卡那霉素和氨苄青霉素的平板上，过夜培养，挑取单菌落至含抗生素的LB培养液中，振荡过夜培养；将获得的菌液提取重组质粒，稀释后作为模板，进行PCR鉴定，即获得烟草叶绿体表达载体pWYP21451。
8.根据权利要求1所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，步骤
(3)中分子检测包括目的基因、选择性标记基因的PCR检测；叶绿体转基因同质化的PCR检测；Southern blot分析；GFP荧光检测；蛋白表达分析。
9.根据权利要求8所述的一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达，其特征在于，所述目的基因、选择性标记基因的PCR检测包括MSI99基因的PCR检测、GFP基因的PCR检测和aadA 基因的PCR检测。
10.一种鉴定上述任一权利要求所述的表达方法表达后对稻瘟病的抗性方法：
首先用MTT法确定最小抑制浓度；
对于活体抗性，接种水稻幼苗的菌液浓度为5×105个孢子/mL，接种后幼苗在温度为28℃，相对湿度为95％的黑暗条件下放置24h；喷施浓度为8.0ug/mL的MSI-99蛋白粗提液一次，48h后再次喷施；每10株幼苗喷施3mL；7天后调查植株发病情况。
权 利 要 求 书1/1页CN 108148857 A
抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达及鉴定表达后的抗性
方法
技术领域
[0001]本发明涉及抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达及鉴定表达后的抗性方法。
背景技术
[0002]稻瘟病是水稻三大真菌性病害之一，国际水稻研究所统计数据表明，稻瘟病每年约造成6000万美
元的经济损失。稻瘟病病原菌生理小种数量多，受气候、品种、栽培耕作习惯等多种因素的影响，年份间不同小种的消长变化无常，采用常规的育种手段难以获得对多个小种均具抗性的水稻品种，结果是一个对当时优势小种具有较强抗性的水稻品种，投放生产后短短几年便可能丧失抗性。通过转几丁质酶基因、壳聚糖基因、抗菌肽和植物防卫素基因和水稻自身抗性基因等手段，提高水稻的抗稻瘟病水平已相继报道，但仅限于实验室水平，目前大田生产中，稻瘟病防控仍以药物为主。
[0003]抗菌肽通常由12-50个氨基酸组成，数量众多，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有抗细菌、真菌和病毒等广谱抗性。抗菌肽MSI-99 是蛙皮素II的衍生物，由23个氨基酸组成，通过His7修饰为Lys，使其避免植物内切酶的影响。氨基酸的改变在保持其功能的同时，使其不易被植物体内的蛋白酶识别而降解，因此这种抗菌肽适用于多种受体材料的遗传转化，在提高农作物的抗病性方面具有很好的应用潜力。基于此，它与另一种抗菌肽Myp30是蛙皮素及其衍生物家族中仅有的两个成功用于农作物转基因的事例。目前，MSI-99基因已经先后被转入烟草、香蕉、西红柿、土豆、油菜、菠萝、葡萄等多种作物中，证实其能够提高作物对多种细菌或真菌性病原体的抗性。尽管Alan等的研究表明转MSI-99基因的番茄对细菌性病原体的抗性明显高于真菌性病害，但DeGray等的研究则证实当MSI-99在植物叶绿体中高效表达时，转基因植株提取物能够抑制3种真菌病原体 Aspergillus flavus、Fusarium moniliforme和Verticillium dahliae 95％以上的孢子萌发。因此，我们选择叶绿体表达MSI-99，研究其对水稻真菌病害的抑制作用。
发明内容
[0004]针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种抗菌肽MSI-99 在烟草叶绿体中的表达，在烟草叶绿体中表达抗菌肽MSI-99基因，提取转基因烟草叶片中的粗蛋白，分析其对9种不同来源的稻瘟病分离物的菌丝体生长是否具有抑制作用，表明烟草叶绿体来源的MSI-99 对多个稻瘟病生理小种具有明显的抑制作用，为培育叶绿体转基因水稻抗稻瘟病新品种以及新型生物农药的研制奠定基础。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种抗菌肽 MSI-99在烟草叶绿体中的表达，包括以下步骤：
[0006]步骤(1)、载体构建；
[0007]步骤(2)、烟草叶绿体转化和同质化筛选；
[0008]步骤(3)、分子检测。
[0009]优选的是，步骤(1)中载体构建包括：MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化；载体pWYP21451的构建，线性化载体的准备；插入片段的准备；重组载体的无缝连接。[0010]上述任一方案优选的是，MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化的具体方法为：WORKS3.0及Synthetic Gene Designer将MSI99基因、aadA基因、GFP基因在不改变其编码的氨基酸序列的情况下，进行密码
子优化工作，并将经过优化后的核苷酸序列进行分析，依次记录其GC含量及分布性、CAI值、最适密码子使用频率、重复序列结构域。
[0011]上述任一方案优选的是，MSI99基因、aadA基因和GFP基因的密码子优化之后，将优化的3个基因序列依次置于烟草Prrn启动子和 Trps16终止子之间，并在每个基因前添加核糖体结合位点，MSI99基因与Prrn启动子紧密相连，且在GFP基因和aadA基因两端添加位点特异性重组位点attP和attB序列。
[0012]上述任一方案优选的是，所述线性化载体的准备方法：取质粒 pEASY-Nt，用Nsi I 酶切，酶切体系37℃反应2h，回收酶切产物，获得载体片段。
[0013]上述任一方案优选的是，所述插入片段的准备方法：将获得的表达框片段无缝连接到线性化的载体片段上，提取质粒pEASY-synth，进行PCR扩展目的片段，所获得的PCR产物经PCR回收试剂盒回收，即为插入片段。
[0014]上述任一方案优选的是，所述重组载体的无缝连接方法：将获得的载体片段和插入片段建立连接体系，将重组的混合液体转化大肠杆菌感受态细胞Mach1，涂于含卡那霉素和氨苄青霉素的平板上，过夜培养，挑取单菌落至含抗生素的LB培养液中，振荡过夜培养；将获得的菌液提取重组质粒，稀释后作为模板，进行PCR鉴定，即获得烟草叶绿体表达载体pWYP21451。
[0015]上述任一方案优选的是，步骤(3)中分子检测包括目的基因、选择性标记基因的PCR检测；叶绿体转基因同质化的PCR检测； Southern blot分析；GFP荧光检测；蛋白表达分析。
[0016]上述任一方案优选的是，所述目的基因、选择性标记基因的PCR 检测包括MSI99基因的PCR检测、GFP基因的PCR检测和aadA基因的PCR检测。
[0017]上述任一方案优选的是，步骤(3)之后还包括转基因烟草中MSI99 的活性分析。[0018]上述任一方案优选的是，所述MSI99的活性分析包括MSI99的热稳定性分析；抗菌肽MSI99对烟草病害的防治分析；抗菌肽MSI99 对稻瘟病的离体和活体抗性活性分析。[0019]本发明还提供一种鉴定上述方法表达后对稻瘟病的抗性方法：
[0020]首先用MTT法确定最小抑制浓度；
[0021]对于活体抗性，接种水稻幼苗的菌液浓度为5×105个孢子/mL，接种后幼苗在温度为28℃，相对湿度为95％的黑暗条件下放置24h；喷施浓度为8.0ug/mL的MSI-99蛋白粗提液一次，48h后再次喷施；每10株幼苗喷施3mL；7天后调查植株发病情况。
[0022]上述任一方案优选的是，所述蛋白粗提液获取方法为按照1:4的质量比，将表达MSI-99的叶绿体转基因烟草新鲜叶片与PBS缓冲液混合后，置于研钵或榨汁机中进行提取获得，并在使用前用清水进行至
少100倍稀释。蛋白粗提液为转基因烟草叶片中提取。[0023]本发明的有益效果是：本发明提供一种抗菌肽MSI-99在烟草叶绿体中的表达及鉴定表达后的抗性方法，在烟草叶绿体中表达抗菌肽MSI-99基因，提取转基因烟草叶片中的粗蛋白，分析其对9种不同来源的稻瘟病分离物的菌丝体生长是否具有抑制作用，表明烟草
叶绿体来源的MSI-99对多个稻瘟病生理小种具有明显的抑制作用，为培育叶绿体转基因水稻抗稻瘟病新品种以及新型生物农药的研制奠定基础。本发明除了在烟草中高效表达了MSI-99，同时首次发现了其对稻瘟病两种病原菌提取物的有效抗性。实验结果表明，一般抗菌肽在100℃高温条件下，可以耐受10-15min而不失活。本发明的耐热试验表明，MSI-99在120℃的高温下，至少可以耐受20min而不丧失活性，这在提高生物农药适应性和延长有效性方面均有益处。
附图说明
[0024]图1、密码子优化及表达框的设计：A，密码子优化前后的生物信息学分析；B，载体烟草叶绿体表达框的结构；GFP：可溶修饰型绿荧光蛋白基因；aadA：氨基糖苷-3'-腺苷转移酶基因；Pprrn、 Trps16：源于烟草叶绿体基因组的调控元件；T7g10：T7噬菌体基因 10的引导序列；attP、attB：重组酶识别位点。
[0025]图2、载体pWYP21451的构建：A：以pEASY-synth为模板，扩增出的约2.8kb的Pprrn-T7g10-sm
GFP-aadA-Trps16表达框；M：100bp Plus DNA Ladder；1、2：PCR产物；B：以质粒pWYP21451为模板，扩增出的约4kb的特异性条带；M：100bp Plus DNA Ladder；1、2： PCR产物；C：插入片段测序结果比对；D:GFP在大肠杆菌中表达情况，携带质粒pWYP21451的大肠杆菌菌液(左侧离心管)和不携带任何质粒的大肠杆菌菌液(右侧离心管)在可见光(上侧图)、紫外光 (下侧图)下的荧光现象；E：载体pWYP21451的构建示意图。
[0026]图3、叶绿体转化植株的同质化筛选、GFP表达和T1代抗性鉴定；A，B，C：在筛选培养基上生长的抗性愈伤或抗性再生植株在第一、第二、第三轮筛选中的情形；D-E：转基因烟草在生根培养基和土壤中的生长情况，E：左侧为转基因植株右侧为野生型植株；F-I：激光共聚焦显微镜下的转基因原生质体，F：白光下的细胞结构，G：叶绿素自身发出的红荧光，H：绿荧光，I：叶绿体发出的荧光叠加的效果；J：T1代同质化转基因植株(1，3，4)在含有500mg/L 壮观霉素的MS培养基上正常生长，而野生型(WT)植株则白化死亡。
[0027]图4、载体pWYP21451对烟草叶绿体基因组的整合过程。
[0028]图5、抗性再生植株分子检测：A：利用引物MSI99重组F，MSI99 重组R对再生植株中目的基因MSI99进行PCR检测；M：200bp marker； -：未转化的烟草植株；+：重组质粒pWYP21451；1-11：部分转基因植株；B：利用引物GFP检测F，GFP检测R对再生植株中目的基因 GFP进行PCR检测；M：
200bp marker；-：未转化的烟草植株；+：重组质粒pWYP21451；1-11：部分转基因植株；C：利用引物aadA检测F，aadA检测R对再生植株中目的基因aadA进行PCR检测。M：100bp Plus landder；-：未转化的烟草植株；+：重组质粒pWYP21451；1-11：部分转基因植株；D：利用引物Nt检测F，Nt检测R对第二轮筛选再生植株的同质化情况进行PCR检测；M：Trans15K DNA Marker；-：未转化的烟草植株；+：重组质粒pWYP21451；1-11：部分转基因植株；E：利用引物Nt检测F，Nt检测R对第3轮筛选再生植株的同质化情况进行PCR检测；M：Trans15K DNA Marker；-：未转化的烟草植株；+：重组质粒pWYP21451；1-5：转基因植株；F：Southern杂交分析；其中M：trans8k DNA Marker；WT：野生型对照；1-4：转基因植株；pEASY-Nt载体Hind III和BamH I间的片段。
[0029]图6、绿荧光蛋白的表达分析，A：紫外灯下野生型对照发出自发的红荧光；B：紫外灯下转基因植株发出绿荧光；C，叶绿素激发出的荧光；D，绿荧光蛋白激发出的荧
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