(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 103205368 A (43)申请公布日 2013.07.17 |
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(21)申请号 CN201310004856.1
(22)申请日 2013.01.08
(71)申请人 浙江省致中和生物健康食品研究院
地址 311607 浙江省杭州市建德市洋溪街道高畈村
(72)发明人 俞建午 李小兵 朱增亮 钱淑芳
(74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公司
代理人 王江成
(51)Int.CI
C12N1/18
C12N11/10
C12N11/04
C12R1/865
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及生物工程技术领域，提供了一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法。本发明步骤为：（1）从市售的生香酵母中筛选得到生香优良的酵母菌株；（2）将对数期生香酵母菌液与海藻酸钠水溶液在室温无菌状态下混合均匀，再将混合液加入到氯化钙水溶液中制备成凝胶球颗粒，然后在2-4℃下固化4-5小时得固定化凝胶颗粒；（3）对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化，循环驯化多次，最后得到耐高温耐乙醇的生香酵母。本发明选用循环梯度驯化法，操作简单、方便，可以筛选出耐高温耐乙醇的酵母菌株，解决了芝兰香型白酒生产中生香酵母的耐高温、耐乙醇性能差的缺陷，提高了发酵能力。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1. 一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法，其特征在于：所述的驯化方法步骤如下：
（1）、以总酯含量和闻香为指标，同时兼顾酒精度，从市售的生香酵母中筛选得到生香优良的酵母菌株；
（2）、将步骤（1）筛选得到生香优良的酵母菌株接入麦芽汁培养基中培养至对数期，获得对数期生香酵母菌液，将对数期生香酵母菌液与海藻酸钠水溶液在室温无菌状态下混合均匀，再将混合液加入到氯化钙水溶液中制备成凝胶球颗粒，然后在2-4℃下固化4-5小时得固定化凝胶颗粒，用无菌水将固定化凝胶颗粒水洗后获得固定化生香酵母；
（3）、对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化，具体设置参数为：循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度范围为：最低浓度为1%-5%，最高浓度为10%-15%；循环梯度驯化的温度范围为：最低温度为28-32 ℃，最高温度为40-45 ℃；每个梯度采用乙醇体积百分比浓度的梯度增幅1%-3%及采用温度梯度增幅0.5℃-3℃；循环驯化多次，最后得到耐高温耐乙醇的生香酵母。
2.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于：步骤（1）具体为：将市售的生香酵母纯化培养后在30℃下用麦芽汁培养基培养7天得发酵液，以国标GB/T 10345-2007为标准，闻香并测定发酵液酒精度、总酯，达标的酵母菌株即为生香优良的酵母菌株。
3.根据权利要求1或2所述的驯化方法，其特征在于：步骤（2）中凝胶球颗粒的具体制备方法为：采用1.0-3.0 g海藻酸钠加入有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，加热溶解后冷却，取3-5 mL对数期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均匀，混合液通过注射器注入1-3%重量百分比浓度的氯化钙水溶液中，制备成凝胶球颗粒。
4.根据权利要求3所述的驯化方法，其特征在于：所述凝胶球颗粒的直径为2-3mm。
5.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于：步骤（3）中循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度范围为：最低浓度为1%-3%，最高浓度为10%-12%；循环梯度驯化的温度范围为：最低温度为28-30℃，最高温度为40-42℃。
6.根据权利要求5所述的驯化方法，其特征在于：循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度梯度具体为：2%、4%、6%、8%、10%、12%，循环梯度驯化的温度梯度具体为：30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃。
7.根据权利要求1或5或6所述的驯化方法，其特征在于：步骤（3）中循环驯化次数为2-5次。
8.根据权利要求1或5或6所述的驯化方法，其特征在于：步骤（3）中每个梯度的驯化时间为24-72小时。
9.根据权利要求8所述的驯化方法，其特征在于：每个梯度的驯化时间为40-48小时。
10.根据权利要求1或2或5或6所述的驯化方法，其特征在于：乙醇驯化培养基由乙醇与YPD液体培养基混合组成。
说 明 书
<p>技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法。
背景技术
生香酵母又称为产酯酵母，能够以乙醇为碳源，既具备酒精发酵能力又具备醋酸发酵能力，能够产生以酯香为主的多种香味物质。其可以以糖、醛、有机酸、盐类为养料，在酯酶作用下合成酯类。芝兰香型白酒兼具酱香味和糊味，因而选育出生香功能强大的生香酵母，将有利于芝兰香型白酒产酯增香、除杂味、使酒体协调，改善芝兰香型白酒质量。
芝兰香型白酒生产采用高温堆积，中温和低温酵母菌细胞生长受到抑制；且随着发酵进行乙醇逐渐积累，当其浓度达到一定值时便会抑制酵母菌的细胞生长和代谢。因此选育优良的耐高温、耐乙醇生香酵母菌株，既能提高芝兰香型白酒生产产率，又能改善芝兰香白酒质量。
CN101831386A的发明公开了一种耐盐生香酵母筛选方法及其工艺，其方法是：采用15W的紫外灯30cm处照射菌悬液而诱变菌种，用透明圈法，初筛到比出发菌种优良的菌种，再通过放在生产曲房与生产成曲同步培养进行复筛，最后将酵母菌经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，得到优质耐盐生香酵母。但是该酵母并不能耐高温、耐乙醇，不适用于芝兰香型白酒生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法，该方法操作简单、方便，可以筛选出耐高温耐乙醇的酵母菌株，适用于芝兰香型白酒生产。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法，所述的驯化方法步骤如下：
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