(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010828506.7
(22)申请日 2020.08.18
(71)申请人 苏州金唯智生物科技有限公司
地址 215000 江苏省苏州市工业园区星湖
街218号生物纳米园C3楼
(72)发明人 曹春艳 赵双 靳开宝 纪磊
韩承昊 朱知浩
(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司
11332
代理人 巩克栋
(51)Int.Cl.
C07H 21/04(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种氨解液及氨解方法，所述
氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液，所述
柱中加入氨解液；（2）将所述固相合成柱置于装
有氨解缓冲液的密封容器内，并保持所述固相合
成柱不接触氨解缓冲液；（3）加热所述密封容器，
使固相载体处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，随后
冷却；（4）从所述密封容器中取出固相合成柱，用
洗脱液处理固相合成柱中的固相载体，并收集流
出液。本发明的氨解液配方温和，氨解缓冲液不
不使用有毒气体、安全性高、环境友好、不破坏引
物结构，同时后处理步骤简单，避免交叉污染，可
以实现大规模工业化应用。
权利要求书2页 说明书11页序列表1页 附图3页CN 111704644 A 2020.09.25
C N 111704644
A
1.一种氨解液，其特征在于，所述氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液； 所述胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液的体积比为(5~10):(1~5):1:(0.01~0.1)。
2.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述胺包括丙胺和/或丁胺。
3.根据权利要求2所述的氨解液，其特征在于，所述丙胺包括正丙胺和/或异丙胺。
4.根据权利要求2所述的氨解液，其特征在于，所述丁胺包括正丁胺、异丁胺、仲丁胺或叔丁胺中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述氨基醇包括氨基丁醇和/或氨基戊醇。
7.根据权利要求6所述的氨解液，其特征在于，氨基戊醇包括5-氨基-1-戊醇和/或4-氨基-1-戊醇。
8.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述碱性水溶液包括LiOH水溶液、NaOH 水溶液、KOH
水溶液、Be(OH)2水溶液、Mg(OH)2水溶液或Ca(OH)2水溶液中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述碱性水溶液的浓度为1~10 M。
10.根据权利要求1所述的氨解液，其特征在于，所述胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液的体积比为(6~8):(2~3):1:(0.04~0.06)。
11.根据权利要求4-8任一项所述的氨解液，其特征在于，所述正丁胺、正丁醇、5-氨基-1-戊醇和碱性水溶液的体积比为(5~10):(1~5):1:(0.01~0.1)。
12.根据权利要求11所述的氨解液，其特征在于，所述正丁胺、正丁醇、5-氨基-1-戊醇和碱性水溶液的体积比为(6~8):(2~3):1:(0.04~0.06)。
13.一种氨解方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）向装有固相载体的固相合成柱中加入权利要求1-12任一项所述的氨解液；
（2）将所述固相合成柱置于装有氨解缓冲液的密封容器内，并保持所述固相合成柱不接触氨解缓冲液；
（3）加热所述密封容器，使固相载体处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，随后冷却；
（4）从所述密封容器中取出固相合成柱，用洗脱液处理固相合成柱中的固相载体，并收集流出液。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述固相载体包括控制孔径玻璃球。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述固相载体上连接有合成的寡核苷酸。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述氨解液浸没固相载体。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述密封容器包括金属密封盒。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氨解缓冲液包括氨水和/或有机胺。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述有机胺包括二乙胺、乙二胺或吡啶中的任意一种或至少两种的组合。
20.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述加热的温度为45~100℃。
21.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述加热的时间为30~60 min。
22.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述冷却为冰浴5~15 min。
23.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述洗脱液包括水和/或Tris -HCl。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述Tris -HCl的浓度为10~30 mM。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述Tris -HCl的pH为7~8。
26.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤（4）所述用洗脱液处理固相合成柱中的固相载体之前，还包括干燥和洗涤所述固相合成柱的步骤。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述干燥为在50~60℃下处理1~5 min。
28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述洗涤采用的洗涤液包括100%乙腈和/或80~95%乙腈。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述洗涤包括：将干燥后的固相合成柱依次采用100%乙腈和80~95%乙腈洗涤。
30.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，在洗涤所述固相合成柱之后还包括离心的步骤。
31.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）向装有连接了合成的寡核苷酸的控制孔径玻璃球的固相合成柱中加入权利要求1-12任一项所述的氨解液，浸没控制孔径玻璃球；
（2）将所述固相合成柱置于装有氨解缓冲液的金属密封容器内，并保持所述固相合成柱不接触氨解缓冲液，所述氨解缓冲液包括氨水和/或有机胺；
（3）将所述金属密封容器在45~100℃下加热30~60 min，使连接了合成的寡核苷酸的控制孔径玻璃球处于氨解缓冲液的蒸汽气氛中，随后冰浴冷却5~15 min；
（4）从所述密封容器中取出固相合成柱，50~60℃下干燥1~5 min，并依次用100%乙腈和80~95%乙腈洗涤，离心后用水和/或10~25 mM pH 7~8的Tris -HCl处理固相合成柱中的固相载体，并收集流出液。
一种氨解液及氨解方法
技术领域
[0001]本发明属于核酸的合成技术领域，涉及一种氨解液及氨解方法。
背景技术
[0002]短链DNA又称为寡核苷酸（Oligo），通常采用固相合成技术进行人工合成。固相合成以控制孔径玻璃球（CPG）为固相载体，以亚磷酰胺为单体，按照3’-5’方向，经过脱保护、缩合、氧化和盖帽四个反应的循环，将目标序列逐渐连接在固相载体上。固相合成方法的优势在于：每一步反应都在固相载体
上进行，反应结束后可以将未反应的原料通过抽滤的方式除去，后处理步骤简单。因此，固相合成被广泛应用于Oligo和多肽合成。在现在大部分的
Oligo合成工艺中，亚磷酰胺单体的5’-OH被二甲氧基三苯基（DMT）基团保护，可以在2
~3%
CCl3COOH/CH2Cl2溶液中被切除，称为脱保护反应；脱保护后裸露出的自由羟基与亚磷酰胺发生亲核取代反应，即缩合反应；缩合反应结束后，为避免未反应的羟基进入下一轮缩合，需要将未反应的自由羟基乙酰化，俗称“盖帽”；最后，由于亚磷酰胺非常不稳定，需要用氧化剂如碘液将亚磷酰胺氧化为+5价磷。每连接一个碱基都需要经历四个反应，将目标碱基全部合成后，将Oligo从CPG上剪切下来。同时，由于A、C、G碱基含有活性氨基，会干扰缩合反应，所以一般预先采用乙酰基（Ac）、苯甲酰基（Bz）和二氮甲基甲脒基（dmf）将氨基保护，当反应结束后，再将Ac、Bz和dmf基团切除。在这里，将Oligo从CPG上剪切下来和脱除保护基的反应称为氨解反应。氨解反应的主要包括：（1）将Oligo从固相载体上切割下来；（2）将Oligo 的3’-OH暴露；（3）将A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf切除；（4）将磷酸上的氰乙基切除。[0003]氨解反应最初采用氨水进行，其问题主要包括反应时间长，55℃反应需要16小时，65℃反应需要8小时；在反应过程中需要将合成柱浸泡在氨水中，容易造成交叉污染；由于氨水可以溶解Oligo，后处理步骤繁琐；氨水中的杂质会积累，造成Oligo污染。后来研发的
甲胺：氨水=1:1（AMA）的氨解反应体降低了反应时间（M.P. Reddy, N.B. Hanna, and F. Farooqui, Nucleos. Nucleot., 1997, 16, 1589-1598.），但是仍然存在交叉污染和后处理步骤繁琐等问题。气相氨解采用氨气为活性介质，以耐高压的氨解锅为反应容器，在高温高压的反应条件下进行氨解反应。气相氨解的优势在于反应快速高效、操作简单，但是存在对设备要求高、需要使用有毒气体、存在安全隐患、污染环境、对引物的结构破坏性较大的缺点。微波氨解是近年来广泛应用的工艺，主要以微波作为加热手段，但是在实际操作过程中，微波加热很容易造成受热不均匀，持续加热会引起液体爆沸，造成损失和引起交叉污染。
[0004]CN109956987A公开了一种用于在DNA固相合成后进行氨解的方法，包括以下步骤：1)向包括用于合成DNA片段的固相载体的合成柱内加入氨解组合物；2)将所述合成柱置于装有氨解缓冲液的可密封容器内，并保持所述合成柱位于所述氨解缓冲液的液面上方；以及3)以微波处理所述可密封容器，使得所述固相载体处于所述氨解缓冲液的蒸汽气氛中；
4)取出所述合成柱，以洗脱液处理所述固相载体并收集流出液。但是该方法仍然存在微波加热受热不均匀、容易造成损伤或引起交叉污染的问题。
[0005]因此，需要研发一种新的氨解方法，反应条件温和，不会破坏引物结构，解决现有技术存在的问题。
发明内容
[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种氨解液及氨解方法，所述氨解液配方温和，氨解缓冲液不仅提供氨解氛围，而且辅助氨解反应，氨解工艺不使用有毒气体、安全性高、环境友好、不破坏引物结构，同时后处理步骤简单，避免交叉污染。
[0007]为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一发明，本发明提供了一种氨解液，所述氨解液包括胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液。[0008]本发明中，胺与两种醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，并去除A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf，其中，胺的作用为氨解液的活性成分，丁醇的作用为反应溶剂，氨基醇兼具有两种作用。
[0009]本发明同时在氨解液中加入微量碱性水溶液，发挥催化剂的作用，与胺、丁醇和氨基醇相互配合，有助于加快氨解反应速率，既起到氨解催化作用，又不影响寡核苷酸的产率和品质。
[0010]优选地，所述胺包括丙胺和/或丁胺。
[0011]优选地，所述丙胺包括正丙胺和/或异丙胺。
[0012]优选地，所述丁胺包括正丁胺、异丁胺、仲丁胺或叔丁胺中的任意一种或至少两种的组合，优选为正丁胺。
[0013]本发明中，采用的丙胺和/或丁胺作为氨解液的活性成分，与丁醇、氨基醇和碱性水溶液相互配合，发挥高效的氨解活性，在特定配比下实现高效的氨解反应。
[0014]优选地，所述丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇或叔丁醇中的任意一种或至少两种的组合，优选为正丁醇。
[0015]优选地，所述氨基醇包括氨基丁醇和/或氨基戊醇。
[0016]优选地，所述氨基戊醇包括5-氨基-1-戊醇和/或4-氨基-1-戊醇，优选为5-氨基-1-戊醇。
[0017]优选地，所述碱性水溶液包括LiOH水溶液、NaOH水溶液、KOH水溶液、Be(OH)2水溶液、Mg(OH)2水溶液或Ca(OH)2水溶液中的任意一种或至少两种的组合。
[0018]优选地，所述碱性水溶液的浓度为1
~10 M，例如可以是1 M、2 M、3 M、4 M、5 M、6
M、7 M、8 M、9 M或10 M，优选为5 M。
[0019]本发明中，将碱性水溶液的浓度限定在1
~10 M的范围内，有助于高效进行氨解反
应，碱性水溶液的浓度不能过低或过高，浓度过低不能发挥促进氨解反应的作用，浓度过高会影响寡核苷酸的产率和纯度，洗脱得到的寡核苷酸在质谱检测时容易产生盐峰，干燥后寡核苷酸可能外观发白。
[0020]优选地，所述胺、丁醇、氨基醇和碱性水溶液的体积比为(5
~10):(1
~
5):1:(0.01
~
0.1)，例如可以是5:1:1:0.01、5:2:1:0.05、5:5:1:0.1、6:1:1:0.01、6:2:1:0.05、6:5:1: 0.1、7:1:1:0.01、7:2:1:0.05、7:5:1:0.1、8:1:1:0.01、8:2:1:0.05、8:5:1:0.1、9:1:1:
0.01、9:2:1:0.05、9:5:1:0.1、10:1:1:0.01、10:2:1:0.05或10:5:1:0.1，优选为(6
~8):(2
~
3):1:(0.04
~
0.06)。
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