(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011049155.6
(22)申请日 2020.09.29
(71)申请人 广东省微生物研究所（广东省微生
地址 510070 广东省广州市越秀区先烈中
路100号大院56号
(72)发明人 张淑红 黄远斌 吴清平 张菊梅
杨广珠 丁郁 薛亮 陈谋通
孙奇凡 叶青华 吴诗 古其会
韦献虎 张友雄
(74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限
公司 44001
代理人 刘明星 朱聪聪
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称
标记、检测引物和检测方法
(57)摘要
本发明公开了用于鉴定植物乳杆菌和戊糖
乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法。鉴定
植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子标记，核
苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID
NO.3或4所示。本发明运用全基因组比对分析技
术筛选了植物乳杆菌和戊糖乳杆菌特异分子检
测新靶标，针对新分子靶标设计引物进行PCR扩
增，可特异性鉴定两种目标菌，目前这些分子标
记未见报道。
与16S rDNA PCR方法和生理生化方法相比，本发明建立的方法具有更高特异性，且
操作简单，检测周期短，无需进一步测序，检测成
本降低，特别适合L.plantarum和L.pentosus快
速初筛，为食品生产企业和检测机构提供了重要
辅助鉴定方法。权利要求书1页 说明书6页序列表3页 附图5页CN 112143820 A 2020.12.29
C N 112143820
A
1.鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子标记，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
2.一种鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的鉴定引物组，其特征在于，是以下任一对引物：_01473-Plant10-F：5'-TGCGACTGGCGATCATTTTG -3'
_01473-Plant10-R：5'-CACGATAACGGCCGCAATTT -3'；
_01473-Plant4-F：5'-TCTCGCATACGCGACTGAAA -3'
_01473-Plant4-R：5'-ACCCCGCTCCGAAATAATGG -3'；
pspA_1-plant1-F：5'-CGGCAACTACCTGTTAGCCA -3'
pspA_1-plant1-R：5'-TCGGTCGGCTTTAGTATCGC -3'；
pspA_1-plant3-F：5'-ATTAGCTTCGCGGATCGGTT -3'
pspA_1-plant3-R：5'-ACGCTCGTATTAGCTGGCTC -3'；
Pentosus_00679-2-F：5'-CCCGTCTTTAAACCGTTCGC -3'
Pentosus_00679-2-R：5'-CAACGCAGCTTGGTGTTTGA -3'；
Pentosus_00679-4-F：5'-GGTCTATTCCCCAGTGACGC -3'
Pentosus_00679-4-R：5'-CGTATTTGGCAACGCAGCTT -3'；
Pentosus_01615-8-F：5'-GCTCGTGTGGATGCTACTGA -3'
Pentosus_01615-8-R：5'-AATGGTCGACCTTCGAGTGC -3'。
3.一种鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应试剂和权利要求2所述的鉴定引物组。
4.一种非疾病的诊断和目的的鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待检测菌株的基因组DNA，以权利要求2所述的鉴定引物组为扩增引物，分别进行PCR反应，观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌，如果出现预期大小的单一条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现目的条带，说明不属于目标菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应，其PCR反应体系组成为：浓度为10μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl 2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，DNA模板2μL，补足无菌去离子水25μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应程序，95℃预变性5min；95℃变性1min，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。
权 利 要 求 书1/1页CN 112143820 A
用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和
检测方法
技术领域：
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的分子标记、检测引物和检测方法。
背景技术：
[0002]在乳杆菌菌属分类地位上，植物乳杆菌和戊糖乳杆菌同属植物乳杆菌类，对革兰氏阳性和阴性致病菌有较好的抑制作用，通过与病原菌营养竞争，抑制病原菌的生长。此外，植物乳杆菌能通过胃并定植于肠道发挥有益作用，具有调节肠道微生态的组成的作用。食品应用方面，植物乳杆菌是工业发酵食品中的主要乳杆菌种类，被广泛用于发酵食品的制备，如酸奶、发酵香肠、面包和泡菜等，部分植物乳杆菌可作为生物防腐剂使用。戊糖乳杆菌(L.pentosus)最初被鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)，而后由于分子生物学的发展，利用recA基因序列差异将其重新划分为L.pentosus。戊糖乳杆菌具有特殊的抗菌和益生性质，在食品发酵和保藏过程中起到了重要的作用，且对人体健康具有促进作用。
[0003]乳杆菌属内许多种形态特征非常相似，传统生化方法往往无法准确区分。部分菌株16S rDNA基因序列也具有较高同源性(L.plantarum和L.pentosus具有99％的相似性)，不能实现亚型分类。乌日拉嘎等利用16S rRNA基因、pheS和pyr G部分基因序列对10株植物乳杆菌及其近缘种进行了区分，以其管家基因pheS和pyrG部分基因序列作为分子标记，结合NCBI数据库中近缘种的相应序列构建系统发育树并与以16S rRNA基因构建的系统发育树进行比较，结果发现基于16S rRNA基因序列不能区分L.plantarum及
其近缘种，pheS和pyr G部基因序列能够区分植物乳杆菌种及其近缘种，pheS用于植物乳杆菌种内分型比pyrG效果更好。将pheS和pyrG部分基因序列串联使用，试验菌株与参考菌株的分类关系更加明晰，联合基因(pheS-pyrG)可作为16S rRNA基因辅助用于植物乳杆菌种及近缘种快速分类鉴定。部分学者根据植物乳杆菌共有的recA基因序列设计种间特异性引物，结合巢式PCR技术，可将将植物乳杆菌中L.plantarum和L.pentosus区分开来，但需要二次PCR扩增。此外，有学者利用dnaK基因序列比对植物乳杆菌类进行了分类。
发明内容：
[0004]本发明的目的是提供一种用于鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子标记。[0005]本发明鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的特异性分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示.
[0006]本发明的第二个目的是提供一种鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的鉴定引物组，是以下7对引物中的一对以上的引物组合：
[0007]_01473-Plant10-F：5'-TGCGACTGGCGATCATTTTG-3'
[0008]_01473-Plant10-R：5'-CACGATAACGGCCGCAATTT-3'；
[0009]_01473-Plant4-F：5'-TCTCGCATACGCGACTGAAA-3'
[0010]_01473-Plant4-R：5'-ACCCCGCTCCGAAATAATGG-3'；
[0011]pspA_1-plant1-F：5'-CGGCAACTACCTGTTAGCCA-3'
[0012]pspA_1-plant1-R：5'-TCGGTCGGCTTTAGTATCGC-3'；
[0013]pspA_1-plant3-F：5'-ATTAGCTTCGCGGATCGGTT-3'
[0014]pspA_1-plant3-R：5'-ACGCTCGTATTAGCTGGCTC-3'；
[0015]Pentosus_00679-2-F：5'-CCCGTCTTTAAACCGTTCGC-3'
[0016]Pentosus_00679-2-R：5'-CAACGCAGCTTGGTGTTTGA-3'；
[0017]Pentosus_00679-4-F：5'-GGTCTATTCCCCAGTGACGC-3'
[0018]Pentosus_00679-4-R：5'-CGTATTTGGCAACGCAGCTT-3'；
[0019]Pentosus_01615-8-F：5'-GCTCGTGTGGATGCTACTGA-3'
[0020]Pentosus_01615-8-R：5'-AATGGTCGACCTTCGAGTGC-3'。
[0021]本发明的第三个目的是提供一种鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的试剂盒，其包括PCR反应试剂和上述鉴定引物组。
[0022]本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和目的的鉴定植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的方法，其包括以下步骤：
[0023]提取待检测菌株的基因组DNA，以上述鉴定引物组为扩增引物，分别进行PCR反应，观察扩增产物的有无，判断是否为目标菌，如果出现预期大小的单一条带，则说明为阳性菌株，如果没有出现目的条带，说明不属于目标菌。
[0024]具体是经PCR扩增和电泳检测，以引物_01473-Plant10-F，_01473-Plant10-R；引物_01473-Plant4-F，_01473-Plant4-R，引物pspA_1-plant1-F，pspA_1-plant1-R，引物pspA_1-plant3-F，pspA_1-plant3-R进行PCR扩增，分别扩增出280bp、214bp、299bp和410bp 的单一目的条带，鉴定为植物乳杆菌；以引物Pentosus_00679-2-F，Pentosus_00679-2-R，引物Pentosus_00679-4-F，Pentosus_00679-4-R，引物Pentosus_01615-8-F，Pentosus_ 01615-8-R分别出现预期大小的417bp、376bp和233bp单一条带，鉴定结果为戊糖乳杆菌。[0025]所述的PCR反应，其PCR反应体系组成为：浓度为10μmol/L的上、下游靶标DNA特异性引物1.0μL，1.5U Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L
MgCl2 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，10×PCR buffer 2.5μL，DNA模板2.0μL，补足无菌去离子水25μL。
[0026]所述的PCR反应程序，95℃预变性5min；95℃变性1min，55-58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。
[0027]本发明运用全基因组比对分析技术筛选了植物乳杆菌和戊糖乳杆菌特异分子检测新靶标，针对新分子靶标设计引物进行PCR扩增，可特异性鉴定两种目标菌，目前这些分子标记未见报道。与16S rDNA PCR方法和生理生化方法相比，本发明建立的方法具有更高特异性，且操作简单，检测周期短，无需进一步测序，检测成本降低，特别适合L.plantarum 和L.pentosus快速初筛，为食品生产企业和检测机构提供了重要辅助鉴定方法。
附图说明：
[0028]图1是引物_01473-plant4扩增产物电泳图，其中0 1500bp marker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；
[0029]图2是引物_01473-plant10扩增产物电泳图，其中0 1500bp marker，1阴性对照，
2-5plant植物乳杆菌；
[0030]图3是引物pspA_1-plant1扩增产物电泳图，其中0 1500bp marker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；
[0031]图4是引物pspA_1-plant3扩增产物电泳图，其中0 1500bp marker，1阴性对照，2-5plant植物乳杆菌；
[0032]图5是引物扩增电泳图，其中引物分别是_01473-plant4(上排左)、_01473-plant10(上排右)、pspA_1-plant1(下排左)、pspA_1-plant3(下排右)，1plant植物乳杆菌、2fer发酵乳杆菌(非目的条带)、3acid嗜酸乳杆菌、4rh鼠李糖乳杆菌、5pen戊糖乳杆菌、6pa 副干酪乳杆菌、7单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、8金黄葡萄球菌ATCC29213、9蜡样芽孢杆菌CMCC63301、10粪链球菌、11大肠杆菌O157 ATCC35150、12大肠杆菌ATCC25922、0 1500bp marker；
[0033]图6是引物Pentosus_01615-8扩增电泳图，其中0 1500bp marker、1-6pe戊糖乳杆菌、7plant植物乳杆菌、8fer发酵乳杆菌、9acid嗜酸乳杆菌、10rh鼠李糖乳杆菌、11cur弯曲乳杆菌、12leu肠膜状明串珠菌、13helv瑞士乳杆菌、14pa副干酪乳杆菌、15单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、16蜡样芽孢杆菌CMCC63301、17粪链球菌、18金黄葡萄球菌ATCC29213、19大肠O157ATCC35150、20阴性对照；
[0034]图7是引物Pentosus_00679-2扩增电泳图，0 1500bp marker、1-6pe戊糖乳杆菌、7plant植物乳
杆菌、8fer发酵乳杆菌、9acid嗜酸乳杆菌、10rh鼠李糖乳杆菌、11cur弯曲乳杆菌、12leu肠膜状明串珠菌、13helv瑞士乳杆菌、14pa副干酪乳杆菌、15单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、16蜡样芽孢杆菌CMCC63301、17粪链球菌、18金黄葡萄球菌ATCC29213、19大肠O157ATCC35150、20阴性对照；
[0035]图8是引物Pentosus_00679-4扩增电泳图，0 1500bp marker、1-6pe戊糖乳杆菌、7plant植物乳杆菌、8fer发酵乳杆菌、9acid嗜酸乳杆菌、10rh鼠李糖乳杆菌、11cur弯曲乳杆菌、12leu肠膜状明串珠菌、13helv瑞士乳杆菌、14pa副干酪乳杆菌、15单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、16蜡样芽孢杆菌CMCC63301、17粪链球菌、18金黄葡萄球菌ATCC29213、19大肠O157ATCC35150、20阴性对照；
[0036]图9是奶酪中植物乳杆菌鉴定(样品+分离株)，各引物扩增电泳图，M:2000bp marker、1-2:_01473-plant4、3-4:pspA_1-plant1、5-6:_01473-Plant10、7-8:pspA_1-plant3；
[0037]图10是酸奶中戊糖乳杆菌鉴定(样品+分离株)，各引物扩增电泳图，M:2000bp marker、1-2:Pentosus_00679-4、3-4:Pentosus_01615-8、5-6:Pentosus_00679-2。
具体实施方式：
[0038]以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0039](1)序列筛选
[0040]从NCBI数据库下载的植物乳杆菌、戊糖乳杆菌及近缘种的全基因组序列。采用软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline，PGAP)中MP方法进行泛基因组分析，通过本地Perl 脚本对分析结果进行处理，获得所有菌株的核心基因及非必须基因信息。根据泛基因组分析结果筛选菌株特有的非必需基因，提取乳杆菌及近缘属种特有的非核心基因蛋白序列，
豫公网安备41160202000603
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