(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011569855.8
(22)申请日 2020.12.26
(71)申请人 上海微谱化工技术服务有限公司
地址 200438 上海市杨浦区国伟路139弄2
号110室
(72)发明人 邵红霞 秦秋明 汪辉 刘婷
(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)
G01N 30/06(2006.01)
G01N 30/72(2006.01)
(54)发明名称药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法(57)摘要本发明涉及亚硝酸盐测试技术领域，更具体地，本发明涉及药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法。包括：标准曲线绘制，亚硝酸盐含量测定。申请人通过在顶空的参数中，使得衍生剂在无机酸的作用下和亚硝酸发生重氮化反应，使得亚硝酸盐反应生成重氮化合物，作为衍生产物，并通过气相谱‑质谱的方式进行检测，具有高的检测灵敏度和准确性；通过控制样品制备过程中的无机酸和衍生剂的添加量，在顶空的参数反应时，可避免甲硝唑药物的分解和重氮衍生产物在无机酸的作用下重新回到脂肪胺的反应，从而具有高的准确度和回收率，且本发明的测定的具有好的可重复性和样品溶液稳定性， 可用于亚硝酸盐的准确定量测定。权利要求书1页 说明书14页 附图2页CN 112782301 A 2021.05.11
C N 112782301
A
1.一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，包括：
标准曲线绘制：取亚硝酸盐‑水混合物，加入无机酸和衍生剂，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空‑气相谱‑质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；
亚硝酸盐含量测定：将药品加入水后，加入无机酸和衍生剂，混合后，得到样品溶液，放入顶空‑气相谱‑质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度。
2.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、硫酸、过氯酸、氟硼酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述衍生剂为胺的水溶液。
4.根据权利要求3所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述胺选自环己基氨基磺酸钠、2,3‑二氨基萘、2,4‑二硝基苯胺、3‑氨基‑N ‑苯基苯磺酰胺、2‑硝基‑4‑氯苯胺中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述无机酸和衍生剂的物质的量比为(100～10)：1。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述标准曲线绘制中，衍生剂和亚硝酸盐的物质的量比为(500～10)：1。
7.根据权利要求1任意一项所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，所述顶空的加热箱温度为45～55℃。
8.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述顶空的加热平衡时间为25～40min。
9.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述气相谱的谱柱：DB ‑WAX UI，30m ×0.25mm ×0.25μm。
10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，用于药物中基因毒性杂质亚硝酸盐的测试。
权 利 要 求 书1/1页CN 112782301 A
药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法
技术领域
[0001]本发明涉及亚硝酸盐测试技术领域，更具体地，本发明涉及药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法。
背景技术
[0002]甲硝唑，是一种抗生素和抗原虫剂。主要用于或预防厌氧菌引起的系统或局部感染，如腹腔、消化道、女性生殖系、下呼吸道、皮肤及软组织、骨和关节等部位的厌氧菌感染，对败血症、心内膜炎、脑膜感染以及使用抗生素引起的结肠炎也有效。破伤风常与破伤风抗毒素(TAT)联用。还可用于口腔厌氧菌感染。
[0003]甲硝唑注射液中可能含有微量亚硝酸盐降解产物亚硝酸盐，其中亚硝酸盐是一种剧毒物质，故为了保证安全，一般规定在0.5％甲硝唑注射液中含亚硝酸根的最高限量确定为不超过20μg/mL，故需要建立对甲硝唑中亚硝酸盐含量的准确定量的测试方法。[0004]目前虽然有一些亚硝酸盐的测试方法，如采用离子谱等，但是一般是用于水体系中亚硝酸盐的检测，且离子谱的测试方法是通过电导检测亚硝酸银离子的浓度，但容易受到氯离子等的影响，造成假阳性结果。而目前也有采用气相谱‑质谱的方法，如CN108008033A，但是适用于水体的检测，且在测定甲硝唑中亚硝酸盐的检测时，因为可能存在的甲硝唑的分解以及在检测过程中使用的目标产物，如重氮的稳定性较差，对甲硝唑中亚硝酸盐的测定产生不利影响，从而较难获得较好准确度、重复性、稳定性等的亚硝酸盐测定结果。
发明内容
[0005]为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，包括：
[0006]标准曲线绘制：取亚硝酸盐‑水混合物，加入无机酸和衍生剂，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的
标准溶液，通过顶空‑气相谱‑质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；
[0007]亚硝酸盐含量测定：将药品加入水后，加入无机酸和衍生剂，混合后，得到样品溶液，放入顶空‑气相谱‑质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度。
[0008]作为本发明一种优选的技术方案，所述无机酸选自盐酸、硫酸、过氯酸、氟硼酸中的一种或多种。 [0009]作为本发明一种优选的技术方案，所述衍生剂为胺的水溶液。
[0010]作为本发明一种优选的技术方案，所述胺选自环己基氨基磺酸钠、2,3‑二氨基萘、2,4‑二硝基苯胺、3‑氨基‑N‑苯基苯磺酰胺、2‑硝基‑4‑氯苯胺中的一种或多种。
[0011]作为本发明一种优选的技术方案，所述无机酸和衍生剂的物质的量比为(100～10)：1。
[0012]作为本发明一种优选的技术方案，所述标准曲线绘制中，衍生剂和亚硝酸盐的物质的量比为(500～10)：1。
[0013]作为本发明一种优选的技术方案，所述顶空的加热箱温度为45～55℃。
[0014]作为本发明一种优选的技术方案，所述顶空的加热平衡时间为25～40min。[0015]作为本发明一种优选的技术方案，所述气相谱的谱柱：DB‑WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm。
[0016]本发明第二个方面提供了一种所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，用于药物中基因毒性杂质亚硝酸盐的测试。
[0017]本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明提供一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，可用于甲硝唑药物中亚硝酸盐的测定，其中申请人通过在顶空的参数中，使得衍生剂在无机酸的作用下和亚硝酸发生重氮化反应，使得亚硝酸盐反应生成亚硝酸酯，作为衍生产物，并通过气相谱‑质谱的方式进行检测，具有高的检测灵敏度和准确性；且申请人发现，通过控制样品制备过程中的无机酸和衍生剂的添加量，在顶空的参数下重氮反应时，可避免甲硝唑药物的分解，从而具有高的准确度和回收率，且本发明的测定的具有好的可重复性和样品溶液稳定性，可用于亚硝酸盐的准确定量测定。
附图说明
[0018]图1为试剂空白溶液的谱图。
[0019]图2为标准曲线溶液(L‑3)的谱图。
[0020]图3为定量限加标溶液的谱图。
[0021]图4为实施例1提供的样品溶液的谱图。
具体实施方式
[0022]参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
[0023]当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。 [0024]单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0025]说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一
个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以
组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
[0026]此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
[0027]以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。[0028]本发明第一个方面提供了一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，包括：[0029]标准曲线绘制：取亚硝酸盐‑水混合物，加入无机酸和衍生剂，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空‑气相谱‑质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；
[0030]亚硝酸盐含量测定：将药品加入水后，加入无机酸和衍生剂，混合后，得到样品溶液，放入顶空‑气相谱‑质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度。
[0031]为了使亚硝酸盐可以在气相谱‑质谱中出峰，申请人通过采用亚硝酸盐和脂肪族胺反应，生成重
氮化的衍生产物，如亚硝酸盐和环己基氨基磺酸钠生成亚硝酸环己酯作为衍生产物，申请人通过测定衍生产物的峰，可绘制和亚硝酸盐浓度的标准曲线，本发明在绘制标准曲线时，不对标准溶液的浓度做具体限定，可列举的有，1.5μg/mL、2.5μg/mL、5μg/ mL、7.5μg/mL、10μg/mL。
[0032]优选地，本发明所述无机酸选自盐酸、硫酸、过氯酸、氟硼酸中的一种或多种，优选的为，盐酸、硫酸。
[0033]进一步优选地，本发明所述胺选自环己基氨基磺酸钠、2,3‑二氨基萘、2,4‑二硝基苯胺、3‑氨基‑N‑苯基苯磺酰胺、2‑硝基‑4‑氯苯胺中的一种或多种，优选的为，环己基氨基磺酸钠、2,3‑二氨基萘。本发明不对衍生剂中胺的重量百分数做具体限定，为本领域熟知的重量百分数，如8～15wt％。
[0034]更进一步优选地，本发明所述无机酸和衍生剂的物质的量比为(100～10)：1，可列举的有，100：1、90：1、80：1、70：1、60：1、50：1、40：1、30：1、20：1、10：1。
[0035]在一种实施方式中，本发明所述标准曲线绘制中，衍生剂和亚硝酸盐的物质的量比为(500：10)：1，500：1、450：1、400：1、350：1、300：1、250：1、200：1、150：1、100：1、90：1、80：1、70：1、60：1、50：1、40：1、30：1、20：1、10：1。
[0036]申请人在进行标准曲线绘制，并测定其线性时，申请人发现，需要选择合适的无机酸和胺，并控
制标准曲线中无机酸和衍生剂的添加量，一般情况下，重氮化反应需要控制胺和亚硝酸盐的摩尔比，且酸的含量不宜太多，因为胺一方面和亚硝酸盐发生重氮化反应，一方面也会和酸成铵盐，但是出于避免样品测定中甲硝唑的分解，且因为药品中亚硝酸盐的含量未知，故需采用大量过量的脂肪胺和无机酸，来促进亚硝酸盐的反应，而申请人发现，通过采用盐酸或硫酸等作为无机酸，并采用环己基氨基磺酸钠等作为衍生剂，可促进亚硝酸盐重氮化的反应的同时，减少标准溶液中重氮化衍生反应的分解，从而使得标准曲线具有高的线性。
[0037]且申请人发现，衍生剂和酸在标准溶液中的浓度也会对线性产生影响，尤其是申请人意外发现，在本发明的标准溶液中，使用相比于衍生剂大量过量的硫酸、盐酸等无机酸时，在促进重氮化进行的同时也有利于保证衍生产物的稳定，避免重新回到胺的结构，而当
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