富马酸二甲酯作为RIPK1抑制剂的应用

富马酸二甲酯作为ripk1 抑制剂的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，特别涉及富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂的应用。

背景技术：

2.受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(ripk1)是决策细胞存活和死亡：ripk1的蛋白酶活性异常导致的ripk1,受体相互作用蛋白激酶3(ripk3)及其底物，混合谱系激酶结构域样蛋白(mlkl)的异常磷酸化，mlkl蛋白寡聚化转移到细胞膜是执行坏死的关键)的主要调节因子，从而响应人类疾病中广泛的炎症和促死刺激。
3.ripk1激酶活化已在自身免疫性和神经退行性疾病的死后人类病理样本中得到证实，并且抑制ripk1激酶活性已在人类疾病的多种动物模型中显示出疗效。由于肿瘤坏死因子受体1(tnfr1)介导的ripk1激活是最全面的表征范式，因此ripk1抑制剂最初被认为主要为肿瘤坏死因子(tnf)驱动的自身免疫性疾病提供抗肿瘤坏死因子(tnf)抗体的小分子替代方案。然而，随着研究的深入，ripk1抑制剂能提供抗肿瘤坏死因子疗法所不能提供的关键选择：1)ripk1抑制剂在中枢神经系统中是安全的，2)ripk1的作用不局限于肿瘤坏死因子(tnf)；3)ripk1由不同的信号分子调控，这些分子与人类自身免疫和自身炎症性疾病的基因有关。且ripk1广泛表达于各种细胞类型，在脂肪、内皮、血管周围细胞簇中表达最为丰富，在免疫细胞簇(树突细胞、巨噬细胞和t细胞)也有所表达。因此如果机体的ripk1信号异常失调则会造成非常严重的后果。
4.另外，ripk1也是内毒素激活toll样受体(tlr)介导信号的关键支架分子；抑制ripk1的泛素化可以抑制内毒素介导的细胞坏死和炎症损伤。因此ripk1抑制剂可望用于内毒素引起的相关疾病，如脓毒血症、痤疮、烧伤感染、急性肺炎、急性肾损伤等。
5.富马酸二甲酯(dimethyl fumarate dmf)作为一种消炎药，已被美国食品和药物管理和欧洲药品管理局批准用于成人患者复发缓解多发性硬化症(relapsing-remitting multiple sclerosis,rrms)以及银屑病。但目前未见dmf用于抑制ripk1活性的相关报道。

技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.本发明第一方面提供了富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂的应用。
9.优选的，上述应用中，所述富马酸二甲酯能够浓度依赖性抑制细胞的程序性坏死。
10.优选的，上述应用中，所述富马酸二甲酯能够有效抑制ripk1的激酶活性。
11.优选的，上述应用中，所述富马酸二甲酯能够阻断肿瘤坏死因子受体(tnfr)和toll样受体(tlr)介导信号。
12.本发明第二方面提供了上述富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂在ripk1异常失
调相关疾病中的应用。
13.优选的，所述ripk1异常失调相关疾病包括但不限于：炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、溶酶体储存障碍、败血症、急性缺血损害脓毒症、脑急性或缺血性损伤、急性或缺血性损害、肿瘤坏死因子(tnf)诱导的全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome sirs)、疮痈溃疡、痤疮、热射病(中暑)、烧伤感染、急性肺炎、急性肾损伤等。
14.本发明第三方面提供了一种用于ripk1异常失调相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有ripk1抑制剂，所述ripk1抑制剂为富马酸二甲酯。
15.本发明具备如下有益效果：
16.(1)本发明中，富马酸二甲酯具有以下功效：能够浓度依赖性抑制细胞的坏死，且毒性小；能够有效抑制ripk1的激酶活性；能够阻断肿瘤坏死因子受体(tnfr)和toll样受体(tlr)介导信号；能够在体内通过抑制ripk1活性和坏死实现对肿瘤坏死因子诱导的全身性炎症反应综合症的。
17.(2)本发明中，富马酸二甲酯可作为ripk1抑制剂ripk1异常失调相关疾病，诸如炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、溶酶体储存障碍、败血症、急性缺血损害脓毒症、脑急性或缺血性损伤、急性或缺血性损害、疮痈溃疡、痤疮、热射病(中暑)、烧伤感染、急性肺炎、急性肾损伤等，为这类疾病提供新的解决方案。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1a为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠巨噬细胞j774a.1经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后的细胞显微图和死亡率统计分析图；
20.图1b为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠骨髓来源巨噬细胞bmdms经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后的细胞显微图和死亡率统计分析图；
21.图2a为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠巨噬细胞j774a.1经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后mlkl的磷酸化的免疫印迹图和对应的灰度统计分析图，最右侧为mlkl寡聚化的免疫印迹图；
22.图2b为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠骨髓来源巨噬细胞bmdms经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后mlkl的磷酸化的免疫印迹图和对应的灰度统计分析图，最右侧为mlkl寡聚化的免疫印迹图；
23.图3a为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠巨噬细胞j774a.1经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后ripk1的磷酸化的免疫印迹图和对应的灰度统计分析图；
24.图3b为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠骨髓来源巨噬细胞bmdms经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后ripk1的磷酸化的免疫印迹图和对应的灰度统计分析图；
25.图3c为富马酸二甲酯及坏死抑制剂预处理后，小鼠骨髓来源巨噬细胞bmdms经肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)处理后ripk1的泛素化的免疫印迹图；
26.图4a为富马酸二甲酯预处理后，尾静脉注射肿瘤坏死因子的小鼠盲肠的解剖图和盲肠切片h.e.染的显微图及对应的组织损伤评分图；
27.图4b为富马酸二甲酯预处理后尾静脉注射肿瘤坏死因子的小鼠子宫的解剖图和子宫切片h.e.染的显微图及对应的组织损伤评分图；
28.图5a为富马酸二甲酯预处理后尾静脉注射肿瘤坏死因子的小鼠盲肠切片磷酸化mlkl和磷酸化ripk3染的免疫荧光显微图及对应的荧光密度统计分析图，右侧为盲肠组织mlkl磷酸化的免疫印迹图；
29.图5b为富马酸二甲酯预处理后尾静脉注射肿瘤坏死因子的小鼠子宫切片磷酸化mlkl和磷酸化rip3染的免疫荧光显微图及对应的荧光密度统计分析图，右侧为子宫组织mlkl磷酸化的免疫印迹图。
具体实施方式
30.以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。
31.本发明提供的富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂在制备ripk1异常失调相关疾病药物组合物中的应用。上述ripk1异常失调相关疾病包括但不限于：一、ripk1调控因子相关的疾病：1)炎症性肠病(克罗恩病和溃疡性肠炎)，2)银屑病，3)类风湿性关节炎，4)中性粒细胞和补体介导的自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮)；二、慢性神经退行性疾病：1)肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆，2)阿尔茨海默病和衰老，3)帕金森病和溶酶体储存障碍；三、败血症和急性缺血损害脓毒症；四、脑急性或缺血性损伤；五、其他急性或缺血性损伤(顺铂、加多铵造影剂、败血症或缺血再灌注诱导的急性肾损伤，乙醇、脂多糖(lipopolysaccharide lps)、对乙酰氨基酚或刀豆素a诱导的肝炎)；六、肿瘤坏死因子(tnf)诱导的全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome sirs)；七、内毒素引起的相关疾病，如脓毒血症、痤疮、烧伤感染、急性肺炎、急性肾损伤等。
32.实施例1
33.1、试剂准备
34.(1)称取富马酸二甲酯(dimethyl fumarate，dmf)，用二甲基亚砜(dmso)充分溶解，配制浓度为20mmol/l的dmf溶液，再离心管分装，冻存于-20℃作为母液备用；
35.(2)阳性对照药物：包括ripk3抑制剂gsk'872以及ripk1抑制剂necrostatin-1(nec-1，ripk1激酶特异性抑制剂)：准确称取gsk'872和nec-1，分别用二甲基亚砜(dmso)充分溶解，配制浓度均为20mmol/l的gsk'872溶液和nec-1溶液，再分别离心管分装，冻存于-20℃作为母液备用。
36.(3)细胞坏死模型诱导药物：包括肿瘤坏死因子tnf-α(t)、smac mimetic lcl-161(s)以及idn-6556(i)：用无内毒素双蒸水复溶tnf-α(t)，再用完全dmem培养基稀释至10μg/ml，分装冻存于-80℃作为母液备用；将smac mimetic lcl-161(s)和idn-6556(i)分别用二甲基亚砜(dmso)充分溶解，配制浓度为20mmol/l的溶液,离心分装冻存于-20℃作为母液备用。
37.(4)sirs动物模型诱导药物：在动物模型试验前，将tnf-α采用无内毒素双蒸水复溶，然后采用无内毒素磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution pbs)将其稀释至浓度为25μg/ml，备用。
38.采用graphpad prism 7.0统计软件分析数据，计量资料以表示，多组间比较，当资料满足正态分布且组间方差齐时，应用单因素方差分析；如不满足上述条件则采用非参数检验(秩和检验)，检验水准为α＝0.05。
39.性能检测
40.2、dmf对坏死、ripk1活性的抑制作用以及sirs的研究
41.(1)dmf对坏死的抑制作用的研究：研究dmf在bmdms和j774a.1细胞上抑制坏死的作用，具体步骤：(1)常规提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,bmdms)，完全培养基调整接种密度至2.5
×
105个/24孔/500μl，1.6
×
106个/6孔/2ml；常规培养小鼠巨噬细胞系j774a.1细胞，完全培养基调整接种密度至8
×
104个/24孔/500μl，3.5
×
105个/6孔/2ml；(2)将不同浓度(12.5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l)的dmf和阳性对照药物(gsk'872：5μmol/l；nec-1：10μmol/l)加入巨噬细胞中预处理1h，然后弃去培养基，换用含药或不含药的tnf-α(t,30ng/ml)+smac mimetic lcl-161(s,10μm)+idn-6556(i,20μm)(tsi)刺激2h。同时设置阳物对照、坏死对照和正常细胞对照；实验结束后以荧光显微镜观察细胞坏死(碘化丙锭(pi红荧光)染法：细胞经处理后，加入2μg/ml的pi和5μg/ml的hoechst 33342，室温染10min后，直接以倒置荧光显微镜观察，pi荧光指示坏死细胞，hoechst 33342荧光(蓝，b)指示所有细胞的细胞核，计数，计算坏死细胞比率，采用免疫印迹法检测mlkl的磷酸化和寡聚化评价dmf对坏死的抑制作用。结果见图1a-1b和图2a-2b。
42.由图1a和图1b结果可知，dmf分别预处理j774a.1细胞和bmdms细胞的剂量依赖性(浓度分别为12.5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l)地抑制tsi诱导的pi阳性(细胞死亡)细胞数，而单独药物剂量对两者均无毒性作用(pi阳性细胞数与正常细胞对照一致)。图1a和图1b中的柱形图分别统计两种细胞pi的阳性率，
***
p《0.001表示(差异极显著)。tsi为公认的诱导细胞发生坏死的模型，pi阳性率降低，表明dmf可以剂量依赖性地抑制细胞坏死。
43.由图2a和图2b结果可知，免疫印迹结果表明，dmf或者阳性对照物(gsk'872和nec-1)分别预处理j774a.1细胞和bmdms剂量依赖性(浓度分别为25μmol/l、50μmol/l)地抑制tsi诱导的mlkl的磷酸化和寡聚化(非还原条件下)，而单独最高药物剂量不会诱导mlkl的磷酸化和寡聚化。图2a和图2b中的中间柱形图分别统计两种细胞内p-mlkl/mlkl的比例，mlkl磷酸化和寡聚化的蛋白越少，表明dmf抑制了坏死和ripk1蛋白的下游，
***
p《0.001(差异极显著)。
44.(2)dmf对ripk1活性抑制作用的研究(免疫印迹法)
45.具体步骤：bmdms和j774a.1细胞处理步骤同(1)，同时设置阳物对照、坏死对
照和正常细胞对照，实验结束后用免疫印迹方法检测ripk1的磷酸化和泛素化，评估dmf对ripk1活性的抑制作用。结果见图3a、图3b和图3c。
46.由图3a和图3b结果可知，dmf或者阳性对照物(gsk'872和nec-1)分别预处理j774a.1细胞和bmdms在各浓度下均能够完全(浓度分别为25μmol/l、50μmol/l)地抑制tsi诱导的ripk1的磷酸化，而单独最高药物剂量不会诱导ripk1的磷酸化。图3a和图3b中的柱形图分别统计了两种细胞内p-ripk1/ripk1的比例，
*
p《0.05(差异有统计学意义)，
***
p《0.001(差异极显著)。
47.由图3c结果可知，最高浓度(50μmol/l)的dmf预处理bmdms，然后采用免疫沉淀技术将目标蛋白ripk1沉淀下来，再通过免疫印迹法检测免疫沉淀样本的泛素(ubiquitin，ub)的量，结果表明，dmf显著抑制ripk1的泛素化，表明dmf能够阻断tnfr(肿瘤坏死因子受体)和tlr介导信号。而ripk1磷酸化和泛素化越少，表明dmf已有效抑制了ripk1的激酶活性。
48.(3)dmf在体内通过抑制ripk1活性和坏死实现对sirs的作用的研究
49.具体步骤：将50mg/kg的dmf预先灌胃c57bl/6小鼠3天，然后尾静脉注射5μg/mouse(200ul)的tnf-α，9h后再劲椎脱臼处死小鼠，取盲肠和子宫，拍照观察盲肠和子宫，然后将盲肠和子宫固定、脱水、石蜡包埋后切片进行h.e.染(显微镜下观察评价dmf对sirs的作用)和免疫荧光染ripk1下游蛋白(p-ripk3和p-mlkl染评价dmf在体内对ripk1活性和坏死的抑制作用)。盲肠和子宫研磨，通过免疫印迹法检测mlkl的磷酸化，进一步评价dmf在体内对ripk1活性和坏死的抑制作用。结果见图4a和和图4b。
50.由图4a和图4b结果可知，tnf-α尾静脉注射9小时后，盲肠均出现了肉眼可见的红肿现象(标记)，且dmf具有明显的保护作用，进一步的对两者进行h.e.染(中图)，显示dmf可以抑制tnf-α诱导的盲肠和子宫损伤，右侧柱状图为对he染组织损伤坏死面积的统计，
***
p《0.001(差异极显著)。
51.为了进一步证明dmf是通过抑制坏死来实现对sirs的，本实施例分别对盲肠和子宫进行免疫荧光染ripk1下游蛋白(p-ripk3和p-mlkl)，结果见图5a和图5b。
52.由图5a和图5b结果可知，dmf能够显著抑制盲肠和子宫的p-ripk3和p-mlkl的表达(左侧)；图5a和图5b中的柱状图为对左图相对荧光密度的统计，
***
p《0.001(差异极显著)。然后对盲肠和子宫进行研磨，通过免疫印迹法检测两者p-mlkl的表达情况(右下侧)，结果得到dmf显著抑制了ripk3和mlkl的磷酸化，表明dmf在体内抑制了ripk1的激酶活性和坏死，进而实现了对sirs的。
53.本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所做出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯能够浓度依赖性抑制细胞的程序性坏死。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯能够有效抑制ripk1的激酶活性。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯能够阻断肿瘤坏死因子受体(tnfr)和toll样受体(tlr)介导的信号。5.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，富马酸二甲酯作为ripk1抑制剂在ripk1异常失调相关疾病中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ripk1异常失调相关疾病选自炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、溶酶体储存障碍、败血症、急性缺血损害脓毒症、脑急性或缺血性损伤、急性或缺血性损伤、肿瘤坏死因子诱导的全身性炎症反应综合症、疮痈溃疡、热射病、烧伤、急性肺炎、急性肾损伤、烧伤感染及其组合。7.一种用于ripk1异常失调相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有ripk1抑制剂，所述ripk1抑制剂为富马酸二甲酯。

技术总结

本发明公开了富马酸二甲酯作为RIPK1抑制剂的应用。富马酸二甲酯具有以下功效：能够抑制细胞坏死；能够有效抑制RIPK1的活性；能够阻断肿瘤坏死因子受体和Toll样受体介导信号；能够在体内通过抑制RIPK1活性和坏死实现对肿瘤坏死因子诱导的全身性炎症反应综合症的。富马酸二甲酯作为RIPK1抑制剂可制备炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、溶酶体储存障碍、败血症、急性缺血损害脓毒症、脑急性或缺血性损伤、疮痈溃疡、热射病、烧伤、急性肺炎、急性肾损伤、烧伤感染等的药物，为这类疾病的提供新的解决方案。方案。