(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810998258.3
(22)申请日 2018.08.29
(71)申请人 北京科技大学
地址 100083 北京市海淀区学院路30号
申请人 北京首佳利华科技有限公司
(72)发明人 万向元 谢科 田有辉 董振营
吴锁伟 安学丽 朱涛涛 张思淼
刘欣洁 李金萍
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称玉米隐性核雄性不育突变基因ms7的功能标记及其应用(57)摘要本发明涉及一种玉米核雄性不育基因ms7的功能标记、功能标记开发方法及其应用。本发明根据突变体基因ms7的突变位点设计了包括但不限于ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3等三个功能标记，其中ms7-IN1能够特异性检测玉米突变体ms7-6007及由其转育的玉米不育材料中的突变基因ms7，并能同时区分野生型Ms7基因和突变型ms7基 因。功能标记ms7-IN2为野生型Ms7基因特异的显性标记，ms7-IN3为突变型ms7基因特异的显性标记。利用本发明设计的功能标记能够准确检测和标记玉米核雄性不育基因ms7或可育基因Ms7的等位基因型，可用于雄性不育株系的鉴定、目标单株的筛选，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值，对提高玉米杂交育种和制种效率、保 障制种质量等方面具有重要意义。
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图5页CN 108998557 A 2018.12.14
C N 108998557
A
1.一种玉米核雄性不育突变体ms7的功能标记ms7-IN1，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms7-IN -1F和第二引物ms7-IN -1R：
ms7-IN -1F：atcccagaggtccatgatctgc
ms7-IN -1R：ggcgacctccaggggccacc。
2.一种玉米核雄性不育突变体ms7的功能标记ms7-IN2，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms7-IN -WF和第二引物ms7-IN -2R：
ms7-IN -WF：gtgtgcaacgcgaactactg
ms7-IN -2R：gtagtccatggcggtgacggag。
3.一种玉米核雄性不育突变体ms7的功能标记ms7-IN3，其特征在于，所述功能标记包括但不限于第一引物ms7-IN -MF和第二引物ms7-IN -2R：
ms7-IN -MF：ccacctgctggctgctgcac
ms7-IN -2R：gtagtccatggcggtgacggag。
4.权利要求1、2和3所述的功能标记，是根据一种玉米核雄性不育突变体ms7-6007的突变基因ms7的突变位点设计，是功能性分子标记，其中权利要求1所述的分子标记，能够同时检测Ms7和ms7等位基因，权利要求2所述的分子标记，为野生型Ms7基因的特异性标记，权利要求3所述的分子标记，为突变型ms7基因的特异性标记。
5.权利要求4所述的核雄性不育突变体ms7-6007，其特征在于，其突变基因ms7位于玉米第7号染体，
对应的野生型可育基因Ms7与花粉发育过程中绒毡层细胞及小孢子细胞壁的发育有关，其突变导致雄花败育。
6.与权利要求1、2和3类似的，根据本发明中的Ms7基因的突变位点设计的其它与Ms7基因共分离的功能标记及开发Ms7功能标记的方法。
7.权利要求1、2、3和6所述的玉米雄性发育相关基因Ms7和突变基因ms7的分子标记分别在检测野生型Ms7和突变基因ms7中的作用。
8.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记和权利要求5所述玉米核雄性不育基因ms7在玉米不育系育种和制种中的应用。
9.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记应用于培育新的遗传背景下的玉米核雄性不育新品系的方法，其特征在于，以具有玉米核雄性不育基因ms7的玉米材料为母本，以其它优良性状玉米自交系为父本，通过杂交并经过多轮回交的方法获得新遗传背景下的玉米核雄性不育系，利用权利要求1、3或4中所述的分子标记，在回交后代中选择同时具有玉米核雄性不育基因ms7、并且具有轮回亲本遗传背景的植株，经过多轮回交，最后通过自交和分子标记辅助筛选获得目标遗传背景下的ms7/ms7纯合隐性不育系，并利用该不育系与父本杂交培育玉米新品种。
10.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记在快速检测玉米核不育基因ms7的等位基因中的应用。
11.权利要求1、2、3和6所述玉米雄性发育相关突变基因ms7的分子标记在玉米亲本纯度鉴定中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108998557 A
玉米隐性核雄性不育突变基因ms7的功能标记及其应用
[0001]
技术领域
[0002]一般地，本发明属于作物分子育种、分子生物学和基因工程领域。具体涉及一种玉米隐性核雄性不育基因ms7的功能标记、功能标记开发方法及与应用。
背景技术
[0003]植物雄性不育（male sterility, MS）是指在高等植物中，雄性器官发育异常，无法产生有功能的雄配子（花粉），但雌性器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性遗传给后代的现象。
[0004] 玉米是重要的粮食作物，其雄性不育材料对玉米的雄花发育机理研究、遗传育种应用、优势研究和应用方面都有重要价值。玉米雄性不育按照不育性遗传方式的差异，可分为3类：细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作雄性不育，其中细胞核雄性不育还可分为显性核不育和隐性核不育，而且以后者为主。由于细胞质母体遗传的原因，细胞质不育基因的F1不能自交结实，因而不能在育种和生产上利用；利用常规杂交育种技术，细胞核雄性不育系的保持和繁殖存在困难，也不能在育种和生产上有效利用；质核互作不育基因，理论和实践上都可以被育种利用，但是该类基因的广泛利用会导致杂交种细胞质单一化，易受专一性病原小种的侵染而导致杂交玉米生产存在巨大的风险。因此，目前国内外玉米杂交育种的父母本大多是可育的自交系，杂交制种时需要对母本进行人工或机械除雄，大大增加了制种成本，同时杂交种纯度也难以得到保障。随着现代生物技术的快速发展，利用作物分子设计技术，并结合常规育种方法，有望将隐性核不育基因有效利用起来。为了能够使核不育基因得到育种利用，必须到核不育后代早期诊断不育性的标记性状从而尽早区分核不育系。因此，从发现玉米隐性核不育材料时起，人们就利用传统育种技术途径，对核不育基因进行了多种标记性状的探索研究，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA 序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种间基因组中某种差异的特定DNA片段。随着分子标记技术的发展，
通过定位克隆获得与玉米重要性状连锁的分子标记或者功能性共分离分子标记，对玉米的基因型鉴定、品种的遗传背景选择、目标单株筛选、品种的遗传改良和纯度鉴定以及克隆雄性器官分化控制基因等方面有重要意义。
发明内容
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一组能够准确检测和标记玉米隐性核雄性不育基因ms7的分子标记，所提供的分子标记是根据不育突变体ms7-6007的基因突变位点设计，
与不育基因ms7共分离，属于功能性共分离分子标记，可用于植株的育性等位基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
[0006]本发明的目的之一：在于提供一种由于育性相关基因Ms7突变获得的完全雄性不育材料ms7-6007。
[0007]本发明的目的之二：在于提供突变材料ms7-6007的基因突变位点。具体的，其基因突变位点主要包含：（1）+22位点处插入CGA三个碱基；（2）+814位点处插入GCTGCTG七个碱基；（3）在+963位点，有TGTGCAACGCGAACTAC等17个碱基的缺失；（4）在+1426位点处出现终止密码子TAA，基因编码提前终止。
[0008]本发明的目的之三：在于提供根据上述ms7突变位点开发ms7功能性分子标记的方法。
[0009]本发明的目的之四：在于提供根据上述突变位点开发的一组功能性分子标记，包括但不限于ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3。功能标记ms7-IN1能同时检测突变等位基因ms7和野生型等位基因Ms7，而ms7-IN2和ms7-IN3分别是野生型Ms7基因和突变型ms7基因的特异标记。
[0010]进一步地，开发的分子标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3以及其它类似的功能性共分离标记包括但不限于以下5条引物序列：
ms7-IN-1F：GGCGACCTCCAGGGGCCACC
ms7-IN-1R：ATCCCAGAGGTCCATGATCTGC
ms7-IN-WF：GTGTGCAACGCGAACTACTG
ms7-IN-2R：GTAGTCCATGGCGGTGACGGAG
ms7-IN-MF：CCACCTGCTGGCTGCTGCAC
其中正向引物序列ms7-IN-1F设计在突变型ms7基因在+814位点插入序列的上游，反向引物序列ms7-IN-
1R设计在此插入序列的下游。因此，ms7-IN1从野生型Ms7基因扩增出的条带比从突变型ms7基因中扩增出条带短7bp，分别为130bp和137bp。
[0011]正向引物ms7-IN-WF设计在野生型Ms7基因的+963位点处，突变型ms7基因在此位点有17个碱基的缺失，ms7-IN-WF针对突变型ms7基因的缺失序列设计，因此为野生型Ms7基因的特异引物。正向引物ms7-IN-MF针对ms7在+814位点处的插入序列设计，为突变ms7基因的特异引物。ms7-IN-WF/ms7-IN-2R和ms7-IN-MF/ms7-IN-2R分别只能从野生型Ms7基因和突变型ms7基因中扩增出453bp和584bp的条带。
[0012]本发明的目的之五：在于提供一种利用上述突变材料开发和选择不同遗传背景下的玉米雄性不育材料的方法。具体的，利用带有上述突变基因ms7的材料做母本，不同优良遗传背景的自交系作为父本，杂交后代与父本自交系连续回交多代，每次回交之前用标记选择带有ms7基因的单株，以获得不同遗传背景下的玉米ms7雄性不育材料，提高优势的利用范围。
[0013]本发明的目的之六：在于在开发和选择不同遗传背景下ms7雄性不育材料过程中，利用上述开发的分子标记进行分子标记辅助选择，加快玉米不育材料的选育进程和提高选择效率。
[0014]本发明的目的之七：在于利用上述开发的分子标记在上一批种子收获后或下一代苗期快速检测玉米ms7等位基因，筛选特定ms7雄性不育单株。
[0015]本发明的目的之八：在于上述开发的功能性分子标记在玉米ms7雄性不育亲本纯度鉴定中的应用，以及检测玉米杂交种是否带有ms7不育等位基因，以判断杂交种的纯度。
附图说明
[0016]图1为玉米Ms7野生型（左）和ms7突变体ms7-6007（右）的雄穗、小花（花药）表型比较图及花粉碘-碘化钾染对比图。
[0017]图2为玉米Ms7野生型和ms7-6007突变型基因的结构示意图。ms7-6007的突变基因在+22位点处插入CGA三个碱基；在+814位点处插入GCTGCTG七个碱基；在+963位点有17个碱基的缺失；在+1426位点处，出现终止密码子TAA，基因编码提前终止。
[0018]图3为本发明中开发的分子标记ms7-IN1、ms7-IN2和ms7-IN3涉及到的5条引物在Ms7基因中的位置示意图（3A）、5条引物在玉米Ms7与ms7 DNA序列比对图中的具体位置标识（3B）以及各标记名称对应的引物序列及扩增产物大小（3C）。
[0019]图4为分子标记ms7-IN1的可行性验证。利用Ms7/Ms7纯合野生型（B73）、Ms7/ms7杂合型（H）和ms7/ms7纯合突变型材料（S）进行功能性分子标记ms7-IN1的多态性验证。ms7-IN1在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）DNA中能够扩增出130bp的条带，在ms7/ms7纯合突变型材料（S）DNA
中能够扩增出137bp的条带，而在Ms7/ms7杂合型（H）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。
[0020]图5为分子标记ms7-IN2和ms7-IN3的可行性验证。利用Ms7/Ms7纯合野生型（B73）、Ms7/ms7杂合型（H）和ms7/ms7纯合突变型材料（S）进行功能性分子标记ms7-IN2和ms7-IN3的多态性验证。ms7-IN2只能在Ms7/Ms7纯合野生型（B73）DNA中能够扩增出453bp的条带，ms7-IN3只能在ms7/ms7纯合突变型材料（S）DNA中能够扩增出584bp的条带，而在Ms7/ms7杂合型（H）材料中，ms7-IN2和ms7-IN3都能扩增出对应的条带。
[0021]图6为利用分子标记ms7-IN1对ms7的杂合型材料Ms7ms7自交获得的F2体的Ms7等位基因进行检测的部分电泳结果。图示中，8个材料的DNA中只能扩增出130bp的条带，为纯合可育系（Ms7/Ms7），标记为F；6个材料的DNA中只能扩增出137bp的条带，为纯合不育系（ms7/ms7），标记为S；14个材料的DNA中能同时扩增出130bp和137bp的条带，为杂合可育型（Ms7/ms7）材料，标记为H。经过后期育性鉴定发现，在苗期基因型鉴定为纯合不育的材料检测为完全雄性不育，而其它材料的植株都雄性可育，与基因型鉴定结果一致，证明共分离标记的有效性。
[0022]图7为利用分子标记ms7-IN2与ms7-IN3对杂合可育株（基因型Ms7/ms7）自交F2体部分材料在苗期进行Ms7等位基因的检测结果。其中，每个材料基因组DNA的扩增结果都分别用ms7-IN2与ms7-IN
3两个分子标记进行检测，电泳图的左侧泳道为ms7-IN2的扩增结果，右侧为ms7-IN3的扩增结果。只能扩增出584bp条带的材料为纯合不育系（ms7/ms7），标记为S；只能扩增出453bp的材料为纯合可育系（Ms7/Ms7），标记为F；两条带都能扩增出的材料为杂合可育型（Ms7/ms7），标记为H。在苗期分子标记检测为不育的材料在后期育性检测中表现为完全雄性不育，与苗期基因型鉴定结果一致。
[0023]图8为利用分子标记辅助选择的方法通过回交转育创制新遗传背景的玉米ms7核雄性不育系的过程示意图。
[0024]图9为利用分子标记ms7-IN1检测回交转育过程中带有ms7突变等位基因材料
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