(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010840082.6
(22)申请日 2020.08.20
司
地址 101111 北京市大兴区北京经济技术
开发区科创六街88号院3号楼12层
(72)发明人 沈月雷 白阳 郭雅南 黄蕤
尚诚彰 姚佳维
(74)专利代理机构 北京领科知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 11690
代理人 徐丹丹 刘玉玲
(51)Int.Cl.
C12N 15/90(2006.01)
C12N 15/113(2010.01)
C12N 5/10(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)C07K 16/28(2006.01)A01K 67/027(2006.01)A61D 19/04(2006.01)A61K 39/395(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种构建动物模型的方法，
所述动物模型通过编辑Cldn18基因，引入移码突
变，不表达Cldn18.2蛋白。采用本方法制备的动
物模型在免疫后表达能够与人Cldn18.2蛋白结
合的抗体，且该抗体与Cldn18.2蛋白特异性结
合。权利要求书1页 说明书15页序列表4页 附图6页CN 111705085 A 2020.09.25
C N 111705085
A
1.一种构建动物模型的方法，其特征在于，包括使用针对Cldn18基因的sgRNA在动物模型Cldn18基因引入功能丧失型突变，使得动物模型不表达Cldn18.2蛋白，其中，所述sgRNA 的靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一项所示。
2.一种如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的功能丧失型突变引入Cldn18基因的1号外显子。
3.一种如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：制备包含SEQ ID NO：1-9任一项所示的sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠。 4.一种如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的动物模型为非人动物；所述非人动物为啮齿类动物；所述啮齿类动物为小鼠。
5.一种Cldn18基因突变的细胞，其特征在于，包括使用针对Cldn18基因的sgRNA在细胞的Cldn18基因引入功能丧失型突变，使得细胞不表达Cldn18.2蛋白，其中，所述sgRNA的靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一项所示。
6.一种靶向Cldn18基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一所示。
7.一种sgRNA载体，其特征在于，包含权利要求6所述的sgRNA。
8.一种权利要求1-4任一所述的方法获得的动物模型或权利要求5所述的细胞在需要涉及细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用，或者在
生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发诊断、策略中的应用，或者在研究Cldn18基因功能、Cldn18抗体、针对Cldn18靶位点的药物或药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
9.一种制备抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括使用权利要求1-4任一所述的方法构建动物模型。
权 利 要 求 书1/1页CN 111705085 A
构建动物模型的方法及应用
技术领域
[0001]本申请涉及基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种Claudin（Cldn）18.2蛋白缺失动物模型的构建方法及其在生物医药研究中的应用。
背景技术
[0002]抗体是生物体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的、能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。由于抗体药物通过毒性较小的免疫学机制发挥作用，与常规药物相比，具有更高的特异性、可靠性和较低的毒副作用，被视为最有发展前途的人类疾病药物种类之一，已成为现今全球药物研发的热点。
[0003]细胞间紧密连接（tight junctions, TJs）结构是一种跨膜蛋白复合体，紧密连接结构的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持，而Cldn蛋白作为构成紧密连接结构的骨架蛋白，主要分布在上皮细胞和间质细胞上，在维持细胞组织构成和功能方面起栅栏和屏障作用。已有研究表明大约90%的恶性肿瘤来源于上皮细胞，上皮细胞间的紧密连接与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤的发生往往伴随着紧密连接功能的降低及紧密连接蛋白表达的改变。
[0004]迄今在哺乳动物中已发现27个Cldn家族成员，分子量为20
~27KDa，其分布具有高
度的组织器官特异性；功能主要为细胞间黏附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化的调节等。Cldn家族蛋白结构包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环，其N末端和C末端在胞浆内。
[0005]Cldn18基因属于Cldn家族，通过可变剪接表达两种蛋白亚型：Cldn18.1和Cldn18.2。研究表明，Cldn18.2在正常情况下仅低水平表达于已分化的胃壁细胞中，在胃干细胞及其他正常人器官中均检测不到，但在多种肿瘤中有显著表达，包括80%的胃肠道腺瘤、60%的胰腺肿瘤，以及部分胆管、卵巢和肺部肿瘤。Cldn18.2的功能、结构特点（两个细胞外环）和特异性表达（在正常组织上几乎没有表达，副作用风险较小），使得该分子成为理想的肿瘤靶点。
[0006]虽然已有许多研究都表明Cldn18.2是一个很好的肿瘤靶点（Ugur Sahin et al. Clin Cancer Res.2008 Dec 1;14(23):7624-34）；Türeci O et al. Gene.2011 Aug 1;481(2):83-92，但到目前为止，仅有1个靶向Cldn18.2的抗体药物（Ganymed的IMAB362）目前准备进入三期临床，主要适应症是胃癌和胰腺癌。公开资料表明，IMAB362通过直接作用于Cldn18.2，激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒作用（CDC）等免疫反应，可单独使用，也可联合化疗药物（如表柔比星、奥沙利铂、卡培他滨）一起起到募集T细胞和改变肿瘤微环境的作用，从而达到杀伤Cldn18.2阳性肿瘤的效果。相比之下，对于只有很少表达或者不表达Cldn18.2的正常组织，IMAB362则不会起到杀伤作用，副作用较小。此外Ganymed还在同时开发Cldn18.2和CD3双特异性抗体，以及抗体偶联药物。[0007]一直以来，胃癌和胰腺癌都是预后最差的恶性肿瘤，也是最为复杂的疾病。由于这两类肿瘤异质性强、各种的有效率低，对其进行的免疫一直是受关注的领域。
鉴于抗Cldn18.2抗体IMAB362的研究结果极大地证明了Cldn18.2作为药物靶点进行肿瘤的可行性，因此本领域有必要加快开发靶向Cldn18.2的多种药物。
[0008]但由于不同物种中Cldn18基因序列高度保守（Türeci O et al. Gene. 2011 Aug 1;481(2):83-92），尤其是小鼠和人Cldn18.1、Cldn18.2分子间存在的高同源性，使得通过常规的免疫普通小鼠的方法很难得到特异性靶向Cldn18.2蛋白的抗体。而且Cldn18基因表达的Cldn18.1、Cldn18.2两种蛋白胞外区较相似，仅在第一胞外结构域之间具有八个氨基酸的差异，因此在抗体研发过程中还需要特别考虑容
易引起交叉反应产生副作用这个问题。Ganymed在研发过程中，为了刺激小鼠免疫系统并克服免疫耐受，采取了多种免疫接种策略，除使用常规的试剂外，还使用了病毒样颗粒(VLP)、肽缀合物和编码人Cldn18.2蛋白的不同片段，共对100多只小鼠进行了多次免疫和加强免疫。得到杂交瘤后，使用包括流式分析、荧光显微术在内的多种方法对得到的抗体进行鉴定、分析抗体与Cldn18.1和Cldn18.2的交叉反应性，筛选得到不超过50个分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系（见专利CN200680043664.X 、CN201380024247.0）。而对于其他靶点的抗体研发过程，如PD-1靶点的抗体开发，其免疫过程仅使用PD-1抗原和免疫佐剂免疫2次小鼠，强化免疫1次，即得到了数千种杂交瘤克隆（见CN105531288A）。可见现有技术在筛选靶向Cldn18.2的抗体上工作量大、流程复杂、效率低下，而且耗费时间、资金和人力巨大。
[0009]鉴于Cldn18.2蛋白在肿瘤和免疫领域具有重大的应用价值，预计将来会有越来越多的国内外制药企业参与到靶向Cldn18.2蛋白的抗体药物研发。为了提高研发效率和成功率，本发明在世界范围内提供一种建立Cldn18.2基因敲除动物模型的方法，并得到Cldn18.2基因敲除动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，通过在Cldn18基因的特定位置进行基因编辑，造成移码突变，使得该动物体内不表达Cldn18.2蛋白，但仍可正常表达Cldn18.1蛋白。该方法在靶向Cldn18.2蛋白的药物研发、筛选及有效性验证等方面有着广阔的应用前景。
发明内容
[0010]本发明的第一方面，涉及一种构建动物模型的方法，包括在动物模型Cldn18基因引入功能丧失型突变，使得动物模型不表达Cldn18.2蛋白。
[0011]优选的，所述的动物模型表达Cldn18.1蛋白。
[0012]优选的，所述的功能丧失型突变为一个或多个。
[0013]优选的，所述的功能丧失型突变为移码突变。
[0014]优选的，所述的功能丧失型突变引入Cldn18基因的1号外显子。优选的，所述的方法包括使用针对Cldn18基因的sgRNA构建动物模型。进一步优选的，所述sgRNA靶向靶位点从Cldn18第1号外显子全部或部分序列中筛选获得。
[0015]更进一步优选的，所述sgRNA的靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一项所示。[0016]在本发明的一个具体实施方式中，所述sgRNA靶向靶位点如SEQ ID NO：7所示。[0017]在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括使用针对Cldn18基因的sgRNA 在动物模型Cldn18基因引入功能丧失型突变，使得动物模型不表达Cldn18.2蛋白，其中，所述sgRNA的靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一项所示。
[0018]在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括以下步骤：
第一步：制备包含SEQ ID NO：1-9任一项所示的sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠。
[0019]进一步还包括：
第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Cldn18基因成功突变，获得Cldn18基因突变阳性小鼠；
第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种数量，建立稳定的Cldn18基因突变小鼠。
[0020]优选所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
[0021]优选的，所述的动物模型为非人动物。优选的，所述非人动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
[0022]本发明的第二方面，提供了一种构建动物模型的方法，包括在动物模型的Cldn18基因的1号外显子引入移码突变，使得动物模型不表达Cldn18.2蛋白。
[0023]优选的，所述的动物模型表达Cldn18.1蛋白。
[0024]优选的，所述的移码突变为插入或删除1对或多对碱基，且插入或删除的碱基对数非3的倍数。优选的为插入或删除1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19或20对碱基。[0025]优选的，获得的动物模型中，Cldn18.2蛋白在所述的动物模型的细胞、组织或器官中不表达。
[0026]本发明的第三方面，提供了一种Cldn18基因突变的细胞，包括使用针对Cldn18基因的sgRNA在细胞的Cldn18基因引入功能丧失型突变，使得细胞不表达Cldn18.2蛋白，其中，所述sgRNA的靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一项所示。
[0027]优选的，所述的细胞表达Cldn18.1蛋白。
[0028]优选的，所述的功能丧失型突变为一个或多个。
[0029]优选的，所述的功能丧失型突变为移码突变。
[0030]优选的，所述的功能丧失型突变引入Cldn18基因的1号外显子。
[0031]进一步优选的，使用针对Cldn18基因的sgRNA构建细胞，其中所述sgRNA的靶向靶位点如SEQ ID NO：1-9任一项所示。优选的，所述的细胞来源的非人动物，进一步优选来源于啮齿类动物，更进一步优选来源于小鼠。
[0032]优选的，所述的细胞来自所有可以原始表达Cldn18.2蛋白的细胞。
[0033]进一步优选的，所述的细胞来自体细胞、干细胞、受精卵细胞等。
[0034]在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞来自上皮细胞、间质细胞、胃壁细胞、肿瘤细胞等。所述的肿瘤细胞包括但不限于胃癌细胞、胰腺癌细胞，以及胆管、卵巢或肺部肿瘤细胞。
[0035]优选的，所述的细胞可以是分离自上述方法构建的动物模型中的任何细胞。[0036]本发明的第四方面，涉及一种靶向Cldn18基因的sgRNA，所述sgRNA靶向靶位点从Cldn18编码区域外显子序列中筛选获得，所述的编码区域为1号外显子区域。
[0037]优选的，所述sgRNA靶向靶位点从Cldn18第1号外显子区域中筛选获得。
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