(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910370639.1
(22)申请日 2019.05.06
(83)生物保藏信息
CGMCC No.16078 2018.07.10
(71)申请人 山东省农业科学院农产品研究所
地址 250100 山东省济南市历城区工业北
路202号
(72)发明人 孙玉霞 赵新节 姜凯凯 原苗苗
王兴凯 管雪强 张翔
(74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有
限公司 37105
代理人 韩百翠
(51)Int.Cl.
C12N 1/16(2006.01)
C12G 3/026(2019.01)
C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一株高酯酶活性美极梅奇酵
母及其在蜂蜜酒发酵中的应用。本发明从葡萄表
皮筛选获得一株高酯酶活性的美极梅奇酵母
(Metschnikowia pulcherrima )MP3007，该菌株
已于2018年07月10日保藏于中国微生物菌种保
藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为
CGMCC No.16078。采用美极梅奇酵母MP3007单独
发酵生产酒精度低于8％v/v的蜂蜜酒，或者与酿
酒酵母混合发酵生产8-16％v/v的蜂蜜酒，发酵
得到的蜂蜜酒保持了蜂蜜本身的典型香气并增
加了复杂的花香，且生产过程无需添加二氧化硫
或采取降温、
离心等方式终止发酵。权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页CN 109913379 A 2019.06.21
C N 109913379
A
1.一株高酯酶活性的美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)MP3007，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.16078。
2.权利要求1所述的美极梅奇酵母MP3007在蜂蜜酒发酵中的应用。
3.一种蜂蜜酒的制备方法，其特征是，在采用蜂蜜水发酵制备蜂蜜酒的过程中，采用权利要求1所述的美极梅奇酵母MP3007单独发酵生产低度的蜂蜜酒，或者，采用权利要求1所述的美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母混合发酵生产8-16％v/v的蜂蜜酒。 4.如权利要求3所述的蜂蜜酒的制备方法，其特征是，所述美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母混合发酵为：美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母同时加入，或者先接种美极梅奇酵母MP3007，发酵72±2小时后再接种酿酒酵母。
5.如权利要求3所述的蜂蜜酒的制备方法，其特征是，所述低度的蜂蜜酒为酒精度低于8％v/v的蜂蜜酒。
6.如权利要求3所述的蜂蜜酒的制备方法，其特征是，所述酿酒酵母为DV10、EC1118或者TOP15。
7.如权利要求3所述的蜂蜜酒的制备方法，其特征是，所述蜂蜜水的浓度为10-28Brix。
权 利 要 求 书1/1页CN 109913379 A
一株高酯酶活性美极梅奇酵母及其在蜂蜜酒发酵中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一株高酯酶活性美极梅奇酵母及其在蜂蜜酒发酵中的应用，属于酿酒技术领域。
背景技术
[0002]蜂蜜酒是由蜂蜜发酵而成的酒精饮料，酒精度一般在8-18％，是世界上最古老的发酵饮料之一。蜂蜜酒不仅保留了天然蜂蜜的营养成分和保健功能，而且提高了氨基酸、维生素、矿物质等重要生物活性物质的含量。作为一种酒精饮品，蜂蜜酒的香气能够表现蜜源植物的特征花香，是决定蜂蜜酒品质的关键因素之一，但是在常规蜂蜜酒的发酵过程中这些易挥发的香气物质大部分会随着发酵温度的升高而挥发，使得发酵结束后的蜂蜜酒花香不明显，特征香气不够突出，往往需要回调少部分蜂蜜以提升花蜜的香气，但这也增加了后期澄清、灭菌等工艺的复杂性及其相应生产成本的提高。
[0003]研究发现，酯类化合物是构成发酵酒果香和花香的重要组成部分，在一定的阈值范围内提高酯类物质含量可增加发酵酒此类香气的浓郁度和复杂度，因此充分利用发酵过程中酵母的产香能力可作为改善香气的有效措施。美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)属非致病菌，已经被报道可以有效降低苹果、葡萄柚、葡萄、番茄和桃等水果采后病害的发生，近年来也有报道美极梅奇酵母具有较为发达的分泌胞外酶的能力，如β-葡聚糖酶(β-glucanase)、酯酶、果胶酶(Pectinase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)和多糖酶(lichenase)等，这些研究尚处于起步阶段，未见对其酶活性的筛选及其在蜂蜜酒及果酒酿造领域中的应用。
发明内容
[0004]本发明的目的是提供一株高酯酶活性美极梅奇酵母及其在蜂蜜酒发酵中的应用。经试验证明美极梅奇酵母MP3007具有高酯酶活性。采用美极梅奇酵母MP3007单独发酵，或者与酿酒酵母混合发酵生产蜂蜜酒，发酵得到的蜂蜜酒保持了蜂蜜本身的典型香气并增加了复杂的花香。
[0005]本发明从葡萄表皮筛选获得一株高酯酶活性的美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)MP3007，该菌株已于2018年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.16078。该美极梅奇酵母MP3007具有高酯酶活性，可以应用于蜂蜜酒的发酵中。
[0006]本发明还提供了一种蜂蜜酒的制备方法，其特征是，在采用蜂蜜水发酵制备蜂蜜酒的过程中，采用美极梅奇酵母MP3007单独发酵生产低度(酒精度＜8％v/v)的蜂蜜酒，或者美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母混合发酵生产8-16％v/v的蜂蜜酒。
[0007]进一步的，美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母混合发酵，优选美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母同时加入，或者先接种美极梅奇酵母MP3007，发酵72±2小时后再接种酿酒酵
母。生产过程无需添加二氧化硫或采取降温、离心等方式终止发酵。
[0008]进一步的，美极梅奇酵母MP3007与酿酒酵母的接种量为(0.5-2.0)*106cfu/mL。[0009]所述酿酒酵母为DV10、EC1118、TOP15等常用的商品酿酒酵母。
[0010]所述蜂蜜可以是枣花、槐花、荆条和百花蜜等蜂蜜，蜂蜜水的浓度根据所发酵酒的产品类型确定，为10-28Brix。
[0011]有益效果：本发明从葡萄表皮筛选获得一株高酯酶活性的美极梅奇酵母MP3007，采用美极梅奇酵母MP3007单独发酵生产低酒精度蜂蜜酒，或者与酿酒酵母混合发酵生产8-16％v/v的蜂蜜酒，发酵得到的蜂蜜酒保持了蜂蜜本身的典型香气并增加了复杂的花香。
附图说明
[0012]图1为美极梅奇酵母MP3007的形态图。
具体实施方式
[0013]实施例1：菌株的分离与鉴定
[0014]1、菌株的分离过程
[0015]无菌称量约10g成熟葡萄粒，放入盛有90ml无菌水三角瓶，振荡培养30分钟，制成菌悬液，稀释至10-2、10-3、10-4，分别吸取50微升放入WL、LYS、ESA固体培养基，用经灭菌的涂布棒涂布均匀，倒置于28℃恒温培养箱中，培养24-72h，待长出菌落后，观察记录形态。根据不同形态分别取单菌落YPD平板划线保存并鉴定。
[0016]2、菌株筛选
[0017]将分离得到的菌株Mp1、Mp2、Mp3和Mp3007接种蜂蜜水(百花蜜，18Brix)进行发酵，接种量为106cfu/mL，同时接种商品酿酒酵母(接种量为106cfu/mL)，并以单独接种2* 106cfu/mL商品酿酒酵母作为对照；每24小时测定发酵液中对硝基苯基乙酸酯酶(C2)，对硝基苯基丁酸酯酶(C4)，对硝基苯基己酸酯酶(C6)，对硝基苯基辛酸酯酶(C8)和β-葡萄糖苷酶的活性，直至发酵结束，进而筛选高酯酶活性的菌株。活性筛选结果如表1所示。[0018]表1：不同菌株发酵过程中酯酶活性(mu/mL)
[0019]
[0020]
[0021]备注：P-NPA、P-NPB、P-NPH、P-NPO和P-NPG依次为对硝基苯基乙酸酯酶(C2)、对硝基苯基丁酸酯酶(C4)、对硝基苯基己酸酯酶(C6)、对硝基苯基辛酸酯酶(C8)和β-葡萄糖苷酶的酶活累积量；Sc为商品酿酒酵母。
[0022]从表1可以看出：采用Mp3007和商品酿酒酵母混合发酵蜂蜜酒，五种酶的活性都是最高的，明显高于单独采用商品酿酒酵母发酵，也明显高于其它菌株和商品酿酒酵母混合发酵，为高酯酶活性菌株。
[0023]3、菌株的鉴定
[0024]1)MP3007菌株的形态如图1所示。
[0025]2)对菌株的26S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如下(SEQ-1)：
[0026]TACAGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTGCTAATTGGCA TACGCCTGGCAATTCTAGAGCTAATACATGCACACAAGCCCAACCTCCGGAAGGGCTGTATTTATTAGATAAAAAA TCAACACTCCAGAAGATTCATAATAACTTGTCGAATCGCAGGGCCTCGGGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTG CCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGGTTCCG GAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGG AGGTAGTGACAATAAATAACGATACAGGGCCCTTTCGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATGTAAATACCTTAA CGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAAGAGCGTATATTAAAGTTGT TGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTTGGGGCGGCCGCGGAGGTCCACTTCTTTGTGAGTACTTTTTGCGGCGG CCCTTCCATGGCCCCTTACAGGGCCATAGTTACTTTGAGTAAATGAGAGTGTTCAAAGCAGGCAAGCGCTTGAATC TTTTAGCATGGAATAATAAAATAGGACGATGATTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCATCGTAATGATTAATAGGG ACGGTCGGGGGCATTAGTATTCAGTTGTAAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCA TTTGTCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAA CCATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGGCGACGCCTCATGTACATGACGCGCCCAGCACCTTACGAGAAATCAAAG TTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGG
AGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGATTGACAGATTGAGAGC TCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAA CGAACGAGACCTTAGCTTTTATTTGCCCGGCCTAACCTTGTGTTGGGTGCGGGCCATAAA。
[0027]经鉴定，确定该菌株属于梅奇酵母属美极梅奇酵母菌，命名为MP3007。该菌株已于2018年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.16078。
[0028]实施例2：发酵制备12％v/v蜂蜜酒
[0029]1、将蜂蜜(百花蜜)加水稀释至20-20.5Brix，加热到65-70℃，保持20分钟，然后降至室温；
[0030]2、将美极梅奇酵母MP3007和酿酒酵母DV10接种于蜂蜜水中进行发酵，美极梅奇酵母接种量为106cfu/mL和酿酒酵母接种量为106cfu/mL；整个发酵过程中，温度保持在18-20℃，每隔24h测定比重，当比重在72h内不再变化时，视为发酵结束。生产过程无需添加二氧化硫或采取降温、离心等方式终止发酵。
[0031]设以下对照组，对不同菌株及不同时间加入酿酒酵母后，发酵的蜂蜜酒的香气成分进行OAV法检测，其中ck：仅使用酿酒酵母发酵；A：酿酒酵母与美极梅奇酵母MP3007同时接种；B：先接种美极梅
奇酵母MP3007，24小时后接种酿酒酵母；C：先接种美极梅奇酵母MP3007，48小时后接种酿酒酵母；D：先接种美极梅奇酵母MP3007，72小时后接种酿酒酵母。发酵结束后采用顶空固相微萃取结合气质联用方法检测蜂蜜酒的挥发性香气成分，以相应标准品外标法定量获得各种成分的含量，并根据其阈值计算OAV值，OAV值＝化合物含量/化合物阈值。实验结果如表2所示。
[0032]表2 接种不同酵母蜂蜜酒中OAV>1的香气成分的OAV值
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