(10)申请公布号 (43)申请公布日 2010.06.02*CN101717432A*
(21)申请号 200910154321.6
(22)申请日 2009.11.26
C07K 14/00(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12N 15/63(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12N 1/19(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
A61K 47/42(2006.01)
A61K 47/48(2006.01)
A61K 8/64(2006.01)
A61Q 19/00(2006.01)
A23L 1/305(2006.01)C02F 1/28(2006.01)C02F 1/62(2006.01)C02F 101/20(2006.01)
(71)申请人王利忠
地址314400 浙江省海宁市海宁大道长山河
桥堍
(72)发明人王利忠
(74)专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有
限公司 33100
代理人
吴关炳
(54)发明名称
中的应用
(57)摘要
如序列表中的序列2所示，或是对序列表中的序
列2所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨
基酸残基而得的氨基酸序列，可用于药品、化妆
品、食品以及水处理等应用中。另外，本发明还公
开了所述聚谷氨酸的制备方法及其应用等。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页CN 101717432 A
C N 101717432 A
1.一种聚谷氨酸，其氨基酸序列
a)如序列表中的序列2所示；或
b)是对序列表中的序列2所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的聚谷氨酸，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
3.一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的聚谷氨酸。
4.权利要求3所述的核酸分子，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
5.一种载体，其含有权利要求3或4所述的核酸分子。 6.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的载体，或者所述细胞已用权利要求3或4所述的核酸分子转化或转染。 7.制备权利要求1或2所述的人肝再生增强因子的方法，其包括，用权利要求6所述的宿主细胞表达权利要求1或2所述的聚谷氨酸，然后分离纯化所述聚谷氨酸。 8.一种组合物，其包含权利要求1或2所述的聚谷氨酸。
9.权利要求8所述的组合物，其为药物组合物、化妆品、食品、或水处理添加剂。
10.权利要求1或2所述的聚谷氨酸在制备药物、化妆品、食品、或水处理添加剂中的应用。
聚谷氨酸及其在药品、化妆品、食品和水处理中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种聚谷氨酸，其均一性佳，可广泛用于药品、化妆品、食品以及水处理等应用中。另外，本发明还涉及所述聚谷氨酸的制备方法及其应用等。
背景技术
[0002] 聚谷氨酸类多肽作为具有增稠、成膜、保湿的水溶性无毒(可生物降解)的多肽产物，可以应用于药品、化妆品、食品以及水处理等方面。现有的聚谷氨酸类多肽包括两类：一类是完全由L-谷氨酸聚合形成的聚谷氨酸，例如中国专利申请CN1607962A、CN101300267A 等所公开的，可作为药品、化妆品、食品的载体或添加剂，但是这类聚谷氨酸完全由L-谷氨酸聚合形成，化学合成难以达到动辄上万道尔顿(D)的分子量，而通过基因工程表达，这类完全相同氨基酸残基重复的多肽的表达量无法难以提高，也没有提高其表达量的文献公开报道；另一类是由L-谷氨酸和D-谷氨酸交替聚合而产生的γ-聚谷氨酸，如中国专利申请N1464864A、CN1556859A、CN1644677A、CN1974432A、CN101061867A等所公开的，其可由芽孢杆菌发酵产生，但是由于并非是直接通过编码基因表达产生的多肽，而是一系列蛋白质产生的结果，因此其发酵产生的γ-聚谷氨酸大小并不均一，多分散性在2-5之间(参见：食品工程，2009(1)：23-26)，也就是说，如果在均一性要求高的领域(如，医药)应用时，需要将发酵产生大大小小的γ-聚谷氨酸混合物进一步提纯保留特定分子量的产物，这样不但成本高昂，而且使得对于最终保留的特定分子量的γ-聚谷氨酸的实际产率低很多。[0003] 为了克服现有技术的缺陷，本发明人经过艰苦的研究，抛弃了以上两种聚谷氨酸的结构，设计了一种能够基因工程高产量制备出的均一的新聚谷氨酸多肽
序列，为推广应用该多肽打下了基础，更令人意外地，这种多肽尽管本身没有抗肿瘤活性，但在与紫杉醇缀合的条件下能够显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性，而且这种多肽仍旧具有清除水体中重金属的效能。
发明内容
[0004] 本发明的要解决的技术问题在于提供一种能够基因工程高产量制备出的均一的新聚谷氨酸多肽序列，从而能够满足大量较低成本的聚谷氨酸产品应用于均一性要求高的领域的要求。另外，本发明还要解决的技术问题在于提供其制备方法、其制备的中间体(如核酸、载体、宿主细胞等)以及其应用和应用的产品。
[0005] 具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种聚谷氨酸，其氨基酸序列
[0006] a)如序列表中的序列2所示；或
[0007] b)是对序列表中的序列2所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
[0008] 在本文中，如未特别指出，术语“聚谷氨酸”、“聚谷氨酸多肽”和“富含聚谷氨酸的多肽”可以互换使用。本发明的第一个方面的聚谷氨酸的氨基酸序列可以是在序列表中的
序列2所示的序列的基础上添加、缺失或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列，并且仍旧能够基因工程高产量制备出的均一的聚谷氨酸、仍旧能够在与紫杉醇缀合的条件下能够显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性、和/或仍旧具有清除水体中重金属的效能。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。目前已经存在可以检验聚谷氨酸功能的实验方法，必要时也可根据本发明实施例所述的具体实验方法从经添加、缺失或取代的氨基酸序列中选出。在本发明的第一个方面中，优选所述聚谷氨酸的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0009] 在第二个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一个方面所述的聚谷氨酸。本发明的核酸分子，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本
领域技术人员可以很容易获得本发明的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸分子。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。该优选序列优化了在大肠杆菌的表达，使得在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达比例可以占到总蛋白的25％。
[0010] 在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。
[0011] 在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三个方面所述
的载体，或者所述细胞已用本发明第二个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适
当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。优选本发明的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。该优选宿主细胞与序列1所示的核苷酸序列配合，能高效表达本发明的聚谷氨酸。
[0012] 在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述聚谷氨酸的方法，其包括，用本发明第四个方面所述的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的聚谷氨酸，然后分离纯化所述聚谷氨酸。
[0013] 在第六个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸。通常，组合物中还可以包括至少一种其它载体，例如生理盐水、缓冲液、和/或去离子水。其中，组合物可以是药物组合物、化妆品、食品、或水处理添加剂。例如，本发明优选提供一种药物组合物，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为活物载体，更优选其中所述活物是紫杉醇。又如，本发明优选提供一种化妆品，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为化妆活性成分的载体。又如，本发明优选提供一
种食品，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为功能性食品成分的载体。又如，本发明优选提供一种水处理添加剂，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为重金属离子的吸附剂，更优选其中所述是Pb离子。
[0014] 在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述聚谷氨酸在制备药物、化妆品、食品、或水处理添加剂中的应用。
[0015] 本发明取得的有益效果有：表达量高；均一性佳；能够显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性；和/或，保留了具有清除水体中重金属的效能。
附图说明
[0016] 图1为为聚谷氨酸表达菌株培养液的SDS-PAGE电泳图，其中左侧泳道上样的是分子量标记(从上至下依次为66kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；泳道1上样的是用IPTG诱导前的培养液；泳道2上样的是用IPTG诱导后的培养液。
[0017] 图2为经纯化的聚谷氨酸的SDS-PAGE电泳图，其中左侧泳道上样的是分子量标记(从上至下依次为从上至下依次为66kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD)；中间和右侧泳道分别上样的是两个不同批次得到的经纯化的聚谷氨酸。
[0018] 为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
具体实施方式
[0019] 以下实施例所述实验方法，没有具体说明的，按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)、《细胞实验指南》(2001年，科学出版社)等实验手册所述的方法进行，或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。[0020] 实施例1.聚谷氨酸表达载体的构建与表达
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议