凝结芽孢杆菌BC99在缓解腹泻型肠易激综合征中的用途的制作方法

凝结芽孢杆菌bc99在缓解腹泻型肠易激综合征中的用途

技术领域

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：1.本发明涉及微生物应用

技术领域

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：，特别涉及凝结芽孢杆菌bc99在缓解腹泻型肠易激综合征中的用途。

背景技术

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：：2.肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)是一组持续或间歇发作，以腹痛、腹胀、排便习惯和(或)大便性状改变为临床表现，而缺乏胃肠道结构和生化异常的肠道功能紊乱性疾病。罗马iv将其列为功能性肠病的一类，患者以中青年人为主，发病年龄多见于20-50岁，女性较男性多见，有家族聚集倾向，常与其他胃肠道功能紊乱性疾病如功能性消化不良并存伴发。按照大便的性状将ibs分为腹泻型(ibs-d)、便秘型(ibs-c)、混合型(ibs-m)和不定型(ibs-u)四种临床类型，我国以腹泻型(ibs-d)多见。3.ibs的病因和发病机制尚不十分清楚，被认为是胃肠动力异常、内脏感觉异常、脑肠调控异常、炎症和精神心理等多种因素共同作用的结果。目前对ibs的只限于对症处理，中华医学会消化病分会胃肠动力学组在《肠易激综合征诊断和的共识意见》中提出目的是消除患者顾虑，改善症状，提高生活质量。4.近年来，许多研究表明肠道菌失调在ibs的发病中起了不容小觑的作用，因此，恢复正常肠道菌对于ibs可能是一个有效的途径。且研究表明使用微生态制剂调节肠道菌紊乱ibs取得了有益的作用，目前已有乳杆菌或双歧杆菌在或缓解ibs的相关专利报道，如专利“一种肠易激综合征的复合益生菌及其制备方法”(cn201210291627)公开了一种肠易激综合征的复合益生菌及其制备方法，该复合益生菌包括：植物乳杆菌，双歧杆菌，干酪乳杆菌，短乳杆菌。另外一篇专利“一种用于肠易激综合征的复合益生菌乳酸菌粉剂及其用途”(cn201910452986.9)公开了一种用于肠易激综合征的复合益生菌粉剂，所述复合益生菌粉剂包括干酪乳杆菌zhang(lactobacilluscaseizhang)，动物双歧杆菌乳亚种v9(bifidobacteriumanimalissubsp.lactisv9)和植物乳杆菌p8(lactobacillusplantarump8)。5.凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)属革兰阳性菌，兼性厌氧，属于硬(或厚)壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，它能产生高浓度的l-乳酸，凝结芽孢杆菌的最早记录见于hammerb.w.在1915年发表的论文，1932年被奥地利著名细菌学家l.m.horowitz-wlassowa和n.w.nowotelnow等人共同鉴定为新的微生物，因其产生乳酸和凝结素，故将其正式命名为凝结芽孢杆菌(拉丁名：bacilluscoagulans)，凝结芽孢杆菌既有与普通乳酸菌十分相似的特征，又因自身芽孢杆菌的特性表现出抗逆性强、耐酸耐碱、耐高温和易于储藏等优良特性，可以抵抗胃酸和生物酶作用，顺利在肠道萌发并发挥其对肠道的有利作用，因此常应用于改善肠道菌结构、调节肠功能紊乱、维持肠道内菌平衡及提高机体免疫水平、营养物质代谢和利用，因此推测其可能在缓解或ibs中发挥一定作用，但目前针对凝结芽孢杆菌在缓解或ibs的潜力中的应用尚未有相关专利报道，基于此本发明公开了一株能缓解腹泻型肠易激综合征的凝结芽孢杆菌bc99及其应用。技术实现要素：6.本发明提供了一株凝结芽孢杆菌bc99，该凝结芽孢杆菌bc99已提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，保藏编号：cgmccno:21801，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，首次公开在中国专利申请cn114686396a中。7.本发明所述的凝结芽孢杆菌菌株bc99具有如下特征：8.形态特征：tsa培养基平板菌落形态为菌落浅黄，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。tsa培养基37℃培养48h，菌体呈杆状，0.4-0.6μm×1.5-4.0μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。9.本发明提供的凝结芽孢杆菌bc99能增加ibs-d模型小鼠中肠道中有益菌丰度，缓解炎症，降低模型小鼠血清中炎症因子含量，增加小鼠肠道中短链脂肪酸含量。附图说明10.图1为凝结芽孢杆菌bc99的形态学特征和电镜图。11.图2为凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠结肠组织病理的影响。12.图3为凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠血清中促炎因子tnf-a含量的影响。13.图4为凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠血清中促炎因子il-6含量的影响。14.图5为凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠血清中促炎因子il-1β含量的影响。15.图6为凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠血清中抗炎因子il-4含量的影响。具体实施方式16.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。17.下述实施例中涉及的检测tnf-α、il-6、il-1β、il-4的elisa试剂盒购自武汉华联科生物技术有限公司；下述实施例中涉及的pca培养基购自青岛海博生物技术有限公司；下述实施例中涉及的粪便基因组dna提取试剂盒货号：dp328购自天根生化科技(北京)有限公司。小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。18.下述实施例中涉及的培养基如下：19.pca液体培养基：葡萄糖1g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，水1000ml，ph7.0～7.2，121℃灭菌20min。20.固体培养基加入15g/l琼脂。21.实施例1凝结芽孢杆菌bc99芽孢悬液的制备22.将凝结芽孢杆菌划线于pca固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落制备悬液，均匀涂布接种于凝结芽孢杆菌接种至产芽孢培养基中，在37℃下，250r/min摇瓶培养48h，得到凝结芽孢杆菌芽孢悬液，离心，收集菌体，用pbs溶液重悬调整菌浓度为1010cfu/ml，得到菌悬液待用。23.实施例2凝结芽孢杆菌bc99干预改善ibs-d模型小鼠疾病活动指数24.(1)ibs-d模型小鼠建模：预利用急性束缚应激(wraprestrainstress,wrs)构建腹泻型肠易激小鼠动物模型，具体方法如下：用乙醚轻度麻醉小鼠，用纸胶带包裹束缚小鼠前肩、前上肢及胸背部以限制其梳理面部、上头和颈部，但不控制其活动。2-5min内小鼠从乙醚麻醉中恢复，并可在笼子中自由走动，自由进食和饮水。每日束缚1次，每次束缚时间2h，共持续14d，随后取造模验证组小鼠测定其粪便含水量，肠道传输功能，体质量，显微镜观察肠黏膜完整性及是否在存在炎症性病变，造模期结束后，采用结直肠扩张法(colorectaldistension,crd)导致的腹壁回撤反射(abdominalwithdrawalreflex,awr)测定小鼠的内脏敏感性。实验结果表明：造模后小鼠粪便含水量增加，肠道传输功能亢进，体质量减轻，肠黏膜完整无溃疡形成但存在在炎症性病变且小鼠内脏敏感性升高，表明造模成功。25.(2)bc99干预实验：取6-8周龄健康雌性c57bl/6j(spf级)小鼠30只，随机分为3组，每组10只，3组分别为：对照组，ibs-d模型组和bc99干预组。对照组正常喂养，后两组采用上述方法造模。随后对照组和模型组正常饲养，每天灌胃0.1ml磷酸盐缓冲溶液，bc99干预组每天灌胃bc990.1ml(1010cfu/ml)，共灌胃14天，在此过程中观察小鼠粪便性状，记录小鼠体重，计算小鼠疾病活动指数(dai)，dai评分系统如表2所示，dai包括三个部分：体重变化、便血情况和粪便性状。26.表1动物疾病活动指数(dai)评分系统[0027][0028]小鼠的疾病活动指数具体结果如表2所示，可以看出与对照组小鼠相比，ibs-d模型组小鼠体重偏低，精神和粪便性状较差甚至有便血出现，其dai指数明显升高，bc99干预后，各项指标均具有明显改善，表明经过bc99干预后，可以有效改善疾病小鼠dai。[0029]表3不同组小鼠的疾病活动指数[0030]对照组ibs-d模型组bc99干预组平均体重(g)22.6±1.89a18.4±1.17b20.9±1.26c精神状态精神良好，活动良好精神萎靡，活动稍差精神较好，活动较好粪便性状正常较为松散甚至有稀便出现正常便血状况无便血少量便血无便血dai0.0±0.00a7.64±0.58b3.23±0.37c[0031]a，b，c表明各组数据存在显著差异，a，b，c表明各组数据之间存在差异[0032]实施例3bc99干预改善ibs-d模型小鼠结肠组织损伤[0033]干预结束后处死小鼠取结肠组织切片并进行苏木精－伊红染后进行组织病理学分析，小鼠结肠组织切片如图2所示。从图中可以看出，对照组小鼠结肠组织正常，ibs-d模型组小鼠结肠组织存在炎症浸润区域及黏膜出血现象，bc99干预组小鼠肠道状态显著改善，几乎无炎症浸润与黏膜出血状况。可见凝结芽孢杆菌bc99干预能维持模型小鼠的结肠组织完整性，减少炎症发生。[0034]实施例4凝结芽孢杆菌bc99干预对小鼠血清炎症因子的影响[0035]干预结束后采集小鼠血液，通过elisa试剂盒按照说明书测定每组小鼠血清中炎症因子tnf-α、il-6、il-1β和il-4的含量。[0036]检测结果如图3所示，对照组小鼠血清中促炎因子tnf-α的含量为20.33±1.69pg/mg，ibs-d模型组小鼠血清中促炎因子tnf-α的含量为32.18±3.26pg/mg，bc99干预组小鼠血清中促炎因子tnf-α的含量为21.56±2.81pg/ml。可见，ibs-d模型组小鼠与对照组相比血清中促炎因子tnf-α的含量显著升高，bc99干预后小鼠血清中促炎因子tnf-α的含量较模型组大幅度下降。[0037]检测结果如图4所示，对照组小鼠血清中促炎因子il-6的含量为14.20±1.88pg/mg，ibs-d模型组小鼠血清中促炎因子il-6的含量为30.82±2.76pg/mg，bc99干预组小鼠血清中促炎因子il-6的含量为17.83±2.55pg/mg。可见，ibs-d模型组小鼠与对照组相比血清中促炎因子il-6的含量显著升高，bc99干预后小鼠血清中促炎因子il-6的含量较模型组有较大幅度下降，已接近对照组。[0038]检测结果如图5所示，对照组血清中促炎因子il-1β的含量为28.26±2.35pg/mg，ibs-d模型组小鼠血清中促炎因子il-1β的含量为38.15±3.38pg/mg，bc99干预组小鼠血清中促炎因子il-1β的含量为25.83±3.72pg/mg，凝结芽孢杆菌bc99的干预显著降低了小鼠血清中促炎症因子il-1β的含量，并能够恢复至正常水平，含量比对照组低。[0039]检测结果如图6所示，对照组血清中抗炎因子il-4的含量为13.21±1.12pg/mg，ibs-d模型组小鼠血清中抗炎因子il-4的含量为8.17±0.94pg/mg，bc99干预组小鼠血清中抗炎因子il-4的含量为13.45±1.35pg/mg。与ibs-d模型组相比较，凝结芽孢杆菌bc99的干预后，il-4在数值上出现了上升趋势，且超过对照组的含量，说明凝结芽孢杆菌bc99可以促进il-4的产生，增强抗炎作用。[0040]实施例5凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠肠道菌中有益菌组成的影响[0041]干预结束后收集小鼠粪便，用粪便基因组dna提取试剂盒提取小鼠粪便细菌宏基因组后，对16srdnav3-v4区序列进行pcr扩增后，通过二代测序仪测定粪便样品中肠道菌的组成差异并计算有益菌(乳杆菌属、双歧杆菌属、阿克曼菌属)的含量，检测结果见表4。从表中可以看出bc99干预增加了ibs-d模型小鼠中有益菌的含量，有效调节了ibs-d模型小鼠肠道菌失衡。可见，凝结芽孢杆菌bc99能够改善肠道菌结构，增加肠道中有益菌乳杆菌属、双歧杆菌属和阿克曼菌属的相对丰度，通过促进肠道菌恢复改善小鼠炎症。[0042]表4不同组小鼠肠道中有益菌的相对丰度[0043]组别lactobacillusbifidobacteriumakkermansia对照组2.18％a3.32％a6.32％aibs-d模型组1.26％b2.86％b4.27％bbc99干预组2.78％c3.29％a7.64％c[0044]注：a，b，c表示各组之间存在显著性差异[0045]尤其地，阿克曼氏菌属的丰度得到明显提高，而这在之前文献中没有报道过。阿克曼氏菌属(akkermansiaspp.)能够以黏蛋白作为唯一碳源和氮源，产生短链脂肪酸来为宿主提供能量。阿克曼氏菌作为益生菌中具有巨大潜力的二代益生菌，在益生菌研究领域中具有独一无二的地位。阿克曼氏菌被广泛认为是改善炎症性肠病、肠易激综合征、糖尿病、肥胖症、酒精肝和阿尔兹海默症等疾病的一种新的潜在候选菌。[0046]因而，本发明还提供了凝结芽孢杆菌bc99在提高肠道中阿克曼氏菌属的丰度的用途，尤其是非医疗目的的用途。[0047]本发明还提供了凝结芽孢杆菌bc99在制备提高肠道中阿克曼氏菌属的丰度的产品上的用途。[0048]实施例6凝结芽孢杆菌bc99对ibs-d模型小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响[0049]干预结束后收集小鼠粪便并进行真空冷冻干燥，准确称取0.05g冻干后的粪便样品溶解于0.5ml饱和氯化钠溶液中，浸泡30min，组织匀浆机匀浆，加入0.02ml浓度为10％的硫酸，震荡30s，在通风橱内向粪便溶液中准确加入0.8ml乙醚溶液，震荡30s后离心15min(8000g、c)，移取上清液至含有0.3g无水硫酸钠的离心管中，震荡均匀，离心15min，取上清至气质容量瓶中，通过gc-ms检测短链脂肪酸含量，检测结果见表5所示，从表中可以看出，与对照组相比，ibs-d模型小鼠中短链脂肪酸含量明显降低，但经bc99干预后小鼠肠道中短链脂肪酸的含量显著高于模型组，部分脂肪酸已接近甚至超过对照组，据文献报道肠道中短链脂肪酸可以有效缓解炎症。可见，凝结芽孢杆菌bc99能够促进ibs-d模型小鼠肠道中短链脂肪酸的产生以缓解炎症。[0050]表5不同组小鼠粪便中短链脂肪酸含量(μmol/g)[0051]组别乙酸丙酸正丁酸异丁酸总量对照组21.23±1.242.21±0.042.35±0.051.46±0.0425.12±1.33aibs-d模型组15.52±0.541.36±0.030.86±0.020.70±0.0318.51±1.08bbc99干预组20.33±1.213.31±0.142.45±0.041.55±0.0527.62±1.86a[0052]注：a，b，c表明各组数据存在显著差异[0053]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12当前第1页12

技术特征：

1.凝结芽孢杆菌bc99在制备改善肠易激综合征产品中的应用，所述凝结芽孢杆菌bc99在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，保藏编号：cgmcc no.21801。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品或药品。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善肠易激综合征包括但不限于如下方面：(1)改善疾病活动指数及结肠组织炎症；(2)减少血清中促炎因子含量；(3)提升血清中抗炎因子含量；(4)提高肠道中有益菌的丰度；(5)提高肠道中短链脂肪酸的含量；4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述血清中促炎因子包括tnf-α、il-6和il-1β；所述血清中抗炎因子包括il-4。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、正丁酸和异丁酸。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有益菌包括乳杆菌属，双歧杆菌属和嗜黏阿克曼菌属。7.凝结芽孢杆菌bc99在非医疗目的提高肠道中阿克曼氏菌属的丰度的用途，所述凝结芽孢杆菌bc99在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，保藏编号：cgmcc no.21801。8.凝结芽孢杆菌bc99在制备提高肠道中阿克曼氏菌属的丰度的产品上的用途，所述凝结芽孢杆菌bc99在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，保藏编号：cgmcc no.21801。

技术总结

本发明公开了凝结芽孢杆菌BC99在缓解腹泻型肠易激综合征中的用途，属于微生物技术领域。本发明是补充凝结芽孢杆菌BacilluscoagulansBC99新的功能应用，此凝结芽孢杆菌功能特性具体体现在：(1)能显著降低IBS-D模型小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量；(2)能够显著提升IBS-D模型小鼠血清中抗炎因子IL-4的含量；(3)能够显著增加IBS-D模型小鼠肠道中乳杆菌、双歧杆菌和嗜粘阿克曼菌等有益菌的丰度；(5)能够显著促进IBS-D模型小鼠肠道中短链脂肪酸的产生。因此凝结芽孢杆菌BC99在制备预防和/或IBS-D的产品中具有巨大的应用前景。的产品中具有巨大的应用前景。的产品中具有巨大的应用前景。