(19)中华人民共和国国家知识产权局
| (12)发明专利说明书 | |
| (10)申请公布号 CN 103076415 A (43)申请公布日 2013.05.01 |
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(21)申请号 CN201210315887.4
(22)申请日 2012.08.31
(71)申请人 南昌大学
地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号
(72)发明人 许恒毅 熊勇华 梁语嫣 罗薇 郭亮 徐峰 赖卫华
(74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有限公司
代理人 施秀瑾
(51)Int.CI
G01N30/08
B01J20/285
B01J20/30
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，涉及食品安全分析领域中样品预处理。本发明方法包括样品经0.1mol/L的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine提取缓冲液预处理、苯酚或苯甲酸修饰的聚苯乙烯超顺磁球吸附、洗脱收集等步骤。洗脱液可以直接上液相或液质联用进行分析，与水产品中四环素类抗生素传统样品前处理方法相比，大大简化了样品前处理的操作流程，缩短了样品前处理时间，减少了吸附剂使用量少，提高了样品中四环素类抗生素的提取得率。 | |
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法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种富集水产品中天然四环素类抗生素的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在水产品肌肉组织中加入适量0.1 mol/L pH4.0的乙二胺四乙酸钠/Mcllvaine缓冲液，样品经匀浆后，离心至明显分层，取上清；
抽提上清液调整pH至5.0-6.0，溶液中加入一定量苯酚或者苯甲酸功能团修饰的聚苯乙烯磁球，充分混匀吸附3-5分钟，磁力架分离磁球，弃去上清；
（2）1-5%甲醇水溶液洗涤磁球2-3次；
（3）加适量内含20%乙腈以及10%的甲醇的0.01 mol/L草酸溶液至吸附有四环素类抗生素的
磁球中，分离磁球，收集洗脱液。
2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于每1 g水产品肌肉组织所需磁球剂量为2-10 mg。
3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于每1 mg吸附有四环素类抗生素的磁球中加入的洗脱液体积为40-80 μL。
4.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于所述表面修饰了一定密度苯酚或者苯甲酸功能团的聚苯乙烯磁球，磁球粒径为70-300 nm之间。
5.根据权利要求1所述的富集方法在分析检测水产品中天然四环素类抗生素中的应用，其特征在于收集洗脱液，过滤，直接上高效液相谱或液质联用进行定量定性分析。
<Claim>6.根据权利要求1~4任一所述的富集水产品中四环素类抗生素的方法，其特征在于所述苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球按照如下步骤制备：
化学共沉淀法合成超顺磁性Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>纳米单颗粒，再将Fe<Sub>3
</Sub>O<Sub>4</Sub>纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.2~0.5%的SDS的NaHCO<Sub>3</Sub>溶液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下功率继续超声乳化30min，形成细乳液；细乳液中加0.1g K<Sub>2</Sub>S<Sub>2</Sub>O<Sub>8</Sub>于70℃反应10~20 min后，然后加入0.5 g对乙烯基苯酚或对乙烯基苯甲酸，继续反应12~16 h；磁架吸附磁球，即获得内含超多个顺磁性Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>纳米颗粒的苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球；磁架回收磁球，制备好的苯酚或苯甲酸功能团修饰的磁球依次采用饱和食盐水、3% NaOH 以及3% HCl 浸泡洗涤各1~3 h，，最后以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液中于4 ℃保存备用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及食品安全分析领域，具体是涉及一种以表面修饰有苯酚或苯甲酸功能团的聚苯乙烯磁球富集水产品中天然四环素类抗生素的磁分散固相萃取方法。
背景技术
四环素类抗生素（Tetracyclines, TCs）是由放线菌产生的一类广谱抗生素，分为天然品（金霉素、土霉素、四环素和强力霉素）与半合成品（多西环素、美它环素、米诺环素和胍哌四环素等）两类。四环素族的化学结构：
<Image></Image>
四环素、土霉素、金霉素及多西环素因其优良的抗菌性、稳定的药性及低廉的价格，广泛应用于水产养殖业中水产疾病的预防、和促进生长。但该类药物的过量使用导致其在可食性动物组织中高浓度残留，直接影响食用者的健康，并导致人体内细菌耐药性增加。世界食品法典委员会和世界各国对水产品中四环素族抗生素残留均有严格的限量要求，国际贸易中也对其限量有严格规定。目前欧洲已禁止该类抗生素作为促生长抗生素应用，美国和日本仍在使用金霉素和土霉素季胺盐，我国仍大量使用土霉素钙盐。因此世界各国对TCs 残留的
检测十分关注，我国和欧盟明确规定：牛奶和肌肉组织中 TCs总含量不得超过100 μg/kg，鸡蛋中TCs总含量不得超过200 μg/kg；美国食品药品监督管理局规定：TC、OTC（土霉素）、CTC（金霉素）在动物肌肉组织中总量不得超过2 μg/g，在牛奶中总量不得超过300 ng/g。
高效液相谱法（High performance liquid chromatography，HPLC），由于具有高效分离及高灵敏度的特点，被广泛用于动物源性食品中四环素类抗生素的分离检测。中华人民共和国国家标准（GB/T 21317-2007）使用HPLC法检测动物源性食品中四环素类兽药残留量，其土霉素、金霉素、四环素的方法检测限为50.0 μg/kg；中华人民共和国水产行业标准（SCT 3015-2002）用HPLC法检测水产品中四环素类抗生素残留量，检测限为：土霉素≤0.05 mg/kg，四环素≤0.05 mg/kg，金霉素≤0.1 mg/kg；中华人民共和国国家标准（GB/T 20764-2006）采用液相谱-紫外检测法对可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量进行测定，该方法检出限可达0.005 mg/kg。目前仪器法检测水产品中四环素类抗生素残留，其样品前处理均采用固相萃取柱进行样品浓缩和净化，柱材料粒径一般为几十至几百微米、材料表面修饰了疏水以及部分亲水性基团。固相萃取柱材料装柱量一般为100至500 mg，过柱速度为每分钟1至3 mL。
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