一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋及其制备方法与应用

1.本发明属组织工程支架术领域，具体涉及一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋及其制备方法与应用。

背景技术：

2.细胞疗法是将具有一定功能性的细胞作为主体的方法，可用于糖尿病、阿尔茨海默氏症和帕金森病等代谢性疾病。将移植细胞(同种异体/异体)与受体自身组织细胞进行物理隔离，以达到内部细胞能发挥功能作用的同时，不会受到机体的免疫系统的攻击。
3.目前，细胞免疫隔离的封装装置大体上有两种：第一种是微囊化封装，它是将细胞注入到微球状胶囊中，从而使其发挥出内部细胞的功能。胶囊的范围通常在300-1000μm之间。但由于尺寸问题内部可容纳的细胞数量非常有限，同时，植入后通常不会固定在被注射部位，如果装置出现问题，回收移植细胞会存在较大的难度。
4.第二种是宏囊化封装，宏封装设备的大小通常为毫米到厘米，从而可以进行大量细胞的封装移植。它们的大尺寸使得宏设备很容易调谐，因为膜的尺寸，厚度和孔径都可以精确调节。与微胶囊相比，宏胶囊化是细胞以大体的形式被包裹的过程。这些细胞被捕获在具有半透膜的空心器件中。宏观封装装置的稳态工作取决于宿主的稳态环境。宏设备的膜由具有结构、功能和机械性能等独特性能的热塑性材料制成。宏囊化细胞封装成为一种内分泌系统、神经系统和代谢紊乱相关疾病的工具。目前，世界各地的许多公司都在聚焦此领域，期望能生产出能应用到临床的产品。
5.封装细胞的目的是防止/最小化免疫反应，而合理选择材料可以减少宿主反应。用于细胞封装的材料必须具有生物相容性，并具有合理的机械强度，以在处理、植入以及宿主施加的机械、生化和生物应力下存活。用于细胞封装的材料有两大类：天然高分子和合成高分子。天然聚合物包括海藻酸盐、琼脂糖、纤维素和胶原带白等，但天然高分子由于本身复杂的生化反应、质量不一致、不明确来源等属性限制了其应用。海藻酸盐是目前最常用于细胞封装的材料，将封装细胞置于藻酸盐水凝胶中，使用注射器滴注法制备了微胶囊，并通过氯化钙使其凝胶化。尽管它具有良好的生物相容性，但纯化过程后残留的任何杂质和内毒素都将作为佐剂触发和/或增强免疫反应；其次，由于包封细胞生物材料的存在，使胰岛和周围的组织之间缺乏直接的血管形成，在其有限区域内扩散仍然是导致胰岛坏死的问题；另外，由于其尺寸问题，如果在移植中或移植后出现问题时回收困难的问题。与天然聚合物相比，合成高分子可以通过化学改性达到不同的物理、化学和生物特性，且与前者相比有更佳的批次间稳定性，并且合成高分子具有可操作性高，灵活度高等优势。
6.目前细胞封装技术的关键挑战是如何促进和维持移植胰岛细胞的活性。移植后细胞必须获得足够的生存所需的营养，并且封装装置要最大程度的阻止免疫细胞，以及介导内部细胞死亡的细胞因子的进入，这就对构成组件的半透膜提出了双重要求，一方面要使小分子如氨基酸、水、氧气等营养物质有效交换；另一方面，要阻止免疫细胞、细胞因子的进
入。这就需要对半透膜材料进行孔径的精确设计。

技术实现要素：

7.为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋。
8.本发明的又一目的在于提供一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的制备方法，本发明的方法工艺简单，操作方便，容易实现产业化，可以制备不同孔径要求的细胞封装囊袋。
9.本发明的再一目的在于提供上述孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的应用。
10.本发明的目的通过下述技术方案实现：
11.一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其特征在于，包括外部功能层和内部支撑层，将两张外部功能层夹持两张内部支撑层，所述内部支撑层贴合在外部功能层内侧，再将外部功能层、内部支撑层边缘封合得到所述细胞封装囊袋；
12.所述外部功能层为多孔半透膜，孔径为20nm～30μm。
13.优选地，所述封装囊袋直径为2cm～5cm，内腔直径为1cm～1.5cm；
14.所述外部功能层厚度为0.1μm～50μm，孔径为40nm～25μm，所述内部支撑层厚度为10μm-100μm，孔径为10μm～1mm。
15.优选地，所述外部功能层组成为聚氨酯，聚醚砜，聚己内酯，聚乳酸，聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种或两种以上；
16.所述内部支撑层组成为聚氨酯，聚己内酯，聚醚砜，聚己内酯，聚乳酸，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯中的一种或两种以上；
17.所述外部功能层和内部支撑层材料相同或不同。
18.优选地，所述细胞封装囊袋还包括一根导管，所述导管前端0.3cm～0.5cm深入囊袋内部，并在此处与内部支撑层和外部功能层边缘封合。
19.一种制备权利要求上述免疫隔离细胞封装囊袋的方法，包括以下步骤：
20.(1)非溶剂诱导相分离的方法制备外部功能层；
21.(2)制备具有一定支撑性的片层支架作为内部支撑层；
22.(3)将两张外部功能层薄膜夹持两张内部支撑层再将边缘封合，得到免疫隔离细胞封装囊袋。
23.优选地，步骤(1)所述非溶剂诱导相分离的方法具体如下：
24.将外部功能层原料、致孔剂、溶剂配置成均相铸膜液，将铸膜液滴加在玻璃基板上用铺膜器刮膜，放入凝固浴中沉淀成膜，取出并烘干得到外部功能层；
25.所述铸膜液总固含量为10-50wt％，所述致孔剂占总固含量的20％-90％，更优选为80～90％，所述致孔剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇的一种或其混合；
26.所述溶剂为n,n
′‑
二甲基甲酰胺，n,n
′‑
二甲基乙酰，氮甲基吡咯烷酮，二甲基亚砜，四氢呋喃其中的一种或其混合；
27.所述凝固浴为纯水，纯乙醇，水和溶剂的混合液，乙醇和溶剂的混合液，其中水或乙醇与溶剂的体积比为65∶35-90∶10，更优选为80∶20；
28.所述铺膜厚度为25-500μm，铺膜温度为4-60℃；
29.步骤(2)所述制备内部支撑层的方法为致孔剂制孔铺膜、添加致孔剂旋涂、3d打印或静电纺丝中的一种。
30.优选地，步骤(2)所述3d打印的打印温度为80～100℃，打印速率为4～6mm/s，按照二维片层模型及其数据进行打印。
31.优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮分子量为6000～10000，所述外部功能层原料分子量为50000～100000；
32.步骤(3)所述的封合方式为直接热封或溶剂封或导丝加热封合。
33.优选地，所述溶剂封为蘸取少量溶剂将膜边缘溶解，风干后粘合；
34.所述直接热封为将两片磁铁在80～100℃放置10～20s后，夹持在外部功能层两面进行封合。
35.优选地，步骤(3)所述封合时，还将一根导管前端0.3～0.5cm深入囊袋内，并在此处与内部支撑层和外部功能层封合；
36.所述导管内径为0.5～0.7mm，外径为1～1.5mm，长为3～5cm。
37.上述的孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋在制备人工细胞中的应用。
38.优选地，在细胞移植前进行预血管化处理，所述预血管化处理为在移植前注入细胞时加入血管内皮生长因子、血管生成素，肝素。
39.与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
40.(1)本发明采用具有半透膜特性的囊袋材料进行包封，为内部细胞与外部组织细胞进行物理隔离，避开宿主免疫系统对囊袋内细胞的攻击的同时实现囊袋内外生物活性物质的交换，方法简单，操作方便，成本低廉，可实现产业化；
41.(2)多孔半透膜的孔径可控，厚度可控，可根据需求来改变，以获得不同渗透截留性的半透膜，可截留大分子蛋白质，对分子量6179da的菊糖也有较高的透过率。
42.(3)由于技术的可操作性，具有广泛的材料适用性，可根据需求，选取不同材料。
43.(4)封装囊袋具有合理的机械强度，采用内部支撑，相对于现有技术的外部支撑，减少了内部细胞与外部环境的距离，更容易使外部生成血管与内部细胞作用，降低移植后前期细胞缺氧死亡的可能。
44.(5)连接有导管的细胞封装囊在注入细胞后直接封管子即可，减少了直接向囊袋注入细胞再封囊袋对囊袋及细胞的污染。
45.(6)本发明制备的细胞囊袋功能层有利于细胞增殖，具有良好的生物相容性，培养30天后，封装囊袋内细胞仍保持良好的增殖活性，达到了内部细胞装载培养的目的，可应用于制备人工细胞，具有广阔的应用前景。
附图说明
46.图1是实施例1、2、3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的整体模型示意图。
47.图2是实施例1、2、3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的剖面结构示意图。
48.图3是实施例1、2、3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的细胞装载方式示意图。
49.图4是实施例1、2、3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的功能示意图。
50.图5是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的外部功能层模型示意图。
51.图6是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的外部功能层实物图。
52.图7是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的外部功能层的场发射扫描电镜图。
53.图8是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的外部功能层对大中小物质的渗透性实验结果图。
54.图9是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的内部支撑层的模型图。
55.图10是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的内部支撑层的体式显微镜透射图。
56.图11是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的内部支撑层的场发射扫描电镜图。
57.图12是实施例1中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的整体实物图。
58.图13是实施例2中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的外部功能层的场发射扫描电镜图。
59.图14是实施例2、3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的内部支撑层模型示意图。
60.图15是实施例2、3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的内部支撑层实物图。
61.图16是实施例3中孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的外部功能层的场发射扫描电镜图。
62.图17是实施例1、2、3细胞囊袋功能层的细胞增殖图。
63.图18是实施例1、2、3细胞囊袋功能层的细胞活死染图，18a为孔板对照；18b为实施例1功能层；18c为实施例2功能层；18d为实施例3功能层。
64.图19是实施例1、2细胞囊袋内部细胞的增殖图。
65.图20是实施例1、2细胞囊袋内部细胞的细胞活死染图。
66.图21为实施例4渗透截留测试自制装置图。
具体实施方式
67.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合实施例对本发明做进一步地详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
68.l929细胞来源华南理工大学国家人体组织功能重建技术研究中心。
69.l929细胞培养基：高糖dmem(含有10％fbs和1％双抗)。
70.导管购自：可孚医疗。
71.商业滤膜pes购自：创伟过滤设备器材。
72.实施例1
73.一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其结构为：
74.(1)由多孔聚氨酯薄膜构成细胞封装囊袋的外部功能层，孔径为40nm-260nm，厚度3μm；(2)利用致孔剂氯化钠致孔构建的微米孔聚氨酯薄膜作为细胞封装囊袋的内部支撑层，孔径10μm，厚度100μm；(3)利用溶剂溶合的方式封合，构建细胞囊袋；(4)在移植前，将血管内皮生长因子(vegf)与细胞共混。
75.本实例中，利用孔径在为40nm-260nm的多孔聚氨酯膜作为其功能层，一方面足够
的孔隙率使小分子的细胞所需营养物质如氨基酸，氧气等可以进行膜内外的有效交换，是内部移植细胞保持活力和功能；另一方面，纳米级孔径可以阻隔免疫细胞、介导内部细胞死亡的细胞因子的进入，达到免疫隔离的作用。在移植前加入内皮生长因子(vegf)与细胞共混，使细胞在植入体内前期可快速产生血管，以避免移植前期缺氧死亡。
76.本实例中的外部功能层的多孔聚氨酯薄膜通过以下方法制备得到：铸膜液体系为聚氨酯/聚乙烯吡咯烷酮/n,n
′‑
二甲基甲酰胺，聚氨酯(mn＝60000),聚乙烯吡咯烷酮(mn＝8000)。本实例中总固含量为40％，其中聚乙烯吡咯烷酮占比80％。配制40g的溶液体系，称取3.2g聚氨酯，12.8g聚乙烯吡咯烷酮于100ml单口烧瓶中，再加入24g n,n
′‑
二甲基甲酰胺，60℃下磁力搅拌6h，待完全溶解后，转移到聚四氟乙烯瓶中待用。配制凝固浴体系，n,n
′‑
二甲基甲酰胺与去离子水体积比20∶80，即1.5l体系中，加入300ml n,n
′‑
二甲基甲酰胺于不锈钢盘中，再加入1200ml去离子水，混匀待用。本实例中，铸膜液在室温下铺膜，将2ml上述配制好的铸膜液滴加到玻璃基板上，25μm铺膜器刮膜，立即放入上述提前配置好的凝固浴中，5分钟后，待铸膜液溶液完全沉淀成膜，从凝固浴中取出放置在硫酸纸上，烘干。
77.本实例中作为内部支撑层的微米孔聚氨酯膜通过以下方法制备得到：将50g粗氯化钠分散到乙醇中利用行星球磨机磨细，球磨转速600rpm，球磨6h。抽滤，收集，烘干。先配置10wt％的聚氨酯/四氢呋喃溶液，即称量20g聚氨酯放置于250ml三口烧瓶中，再称量180g四氢呋喃倒入烧瓶中，磁力搅拌6h，待完全溶解，转移到聚四氟乙烯瓶中，待用。按照理论计算孔隙率75％时应加入的氯化钠质量和聚氨酯/四氢呋喃溶液质量，先称取10g10％聚氨酯/四氢呋喃溶液于小烧瓶中，再加入5.7880g球磨氯化钠粉末，磁力搅拌1h，待溶液混匀后使用。吸管吸取2ml溶液滴加在玻璃基板上，250μm铺膜器刮膜，自然风干，放入去离子水中，浸泡1h，完全浸出其中的氯化钠，烘干。
78.由于本实例中外部功能层与内部支撑层均为聚氨酯材料，所以选取简单的溶剂封合的方式将外部功能层、内部支撑层边缘溶合在一起，溶剂为n,n
′‑
二甲基甲酰胺，先蘸取少量溶剂将膜边缘溶解，将聚氨酯导管约有0.5cm伸入囊袋内部(导管为内径0.5mm，外径1mm，长3cm的商品化医用导管)，在0.5cm处与膜边缘粘合，风干后就粘合在一起。其中纳米孔功能层在囊袋外部，大孔支撑层贴合在功能层内侧作为“骨架”，最终得到整体直径为2cm，内腔直径为1.5cm，功能层孔径为40nm-260nm，支撑层孔径为10μm的细胞囊袋。
79.本实施例中细胞封装囊袋的整体模型示意图如图1所示；细胞封装囊袋的剖面模型示意图如图2所示；细胞封装囊袋的细胞注入方式如图3所示；细胞封装囊袋的功能示意图如图4所示；细胞封装囊袋的外部功能层模型如图5所示；细胞封装囊袋的外部功能层实物图如图6所示；细胞封装囊袋的外部功能层的场发射扫描电镜图如图7所示；细胞封装囊袋的外部功能层对大中小物质的渗透性实验结果如图8所示；细胞封装囊袋的内部支撑层模型如图9所示；细胞封装囊袋的内部支撑层的体式显微镜投射图如图10所示；细胞封装囊袋的内部支撑层的场发射扫描电镜图如图11所示，图11为实施例1的功能层的sem图像，宏观上看，孔径小于1μm，使用image j测量，孔径在40nm-260nm；细胞封装囊袋实物图如图12所示，图12为实施例1细胞囊袋的实物图，整体直径为2cm，内腔直径为1.5cm，并且连接一根内径0.5mm，外径1mm，长3cm的聚氨酯导管。
80.实施例2
81.一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其结构为：
82.(1)由多孔聚氨酯薄膜构成细胞封装囊袋的外部功能层，孔径在80nm-2μm，厚度20μm；(2)利用3d打印作为细胞封装囊袋的内部支撑层，孔为1mm
×
1mm，厚度100μm；(3)利用热熔的方式封合，构建细胞囊袋；(4)在移植前，将血管内皮生长因子(vegf)与细胞共混。
83.本实例中，利用孔径在80nm到2μm不等的多孔聚氨酯膜作为其功能层，相比于实例1，孔径更大，细胞所需营养物质可以更加有效地进行交换，可以装载更耗氧更需氧气的细胞；另一方面，可以阻隔免疫细胞、介导内部细胞死亡的细胞因子的进入，达到免疫隔离的作用。在移植前加入内皮生长因子(vegf)与细胞共混，使细胞在植入体内前期可快速产生血管，以避免移植前期缺氧死亡。
84.本实例中的外部功能层的多孔聚氨酯薄膜通过以下方法制备得到：铸膜液体系为聚氨酯/聚乙烯吡咯烷酮/n,n
′‑
二甲基甲酰胺，聚氨酯(mn＝60000),聚乙烯吡咯烷酮(mn＝8000)。本实例中总固含量为50％，其中聚乙烯吡咯烷酮占比85％。配制40g的溶液体系，称取3g聚氨酯，17g聚乙烯吡咯烷酮于100ml单口烧瓶中，再加入20g n,n
′‑
二甲基甲酰胺，60℃下磁力搅拌6h，待完全溶解后，转移到聚四氟乙烯瓶中待用。配制凝固浴体系，n,n
′‑
二甲基甲酰胺与去离子水体积比20∶80，即1.5l体系中，加入300ml n,n
′‑
二甲基甲酰胺于不锈钢盘中，再加入1200ml去离子水，混匀待用。本实例中，铸膜液在60℃下铺膜，将2ml上述配制好的铸膜液滴加到玻璃基板上，250μm铺膜器刮膜，立即放入上述提前配置好的凝固浴中，5分钟后，待铸膜液溶液完全沉淀成膜，从凝固浴中取出放置在硫酸纸上，烘干。
85.本实例中作为内部支撑层的通过以下方法制备得到：利用3d打印机机将聚己内酯(pcl)线材按照二维片层模型及其数据(片层模型为图14，孔为1mm
×
1mm，厚度100μm)进行打印，制备3-10个该结构的二维片层材料；其中，打印温度为80℃，打印速率为4mm/s，二维支架片层材料厚度为0.1mm；
86.本实施例中的外部功能层和内部支撑层的封合方式是采用加热磁铁热封法。具体步骤为将两片磁铁(外径2.5cm,内径2cm)在80℃加热板放置10s后，夹持在膜的两面，将聚氨酯导管约有0.5cm伸入囊袋内部(导管为内径0.5mm，外径1mm，长3cm)，在0.5cm处与膜边缘封合。其中纳米孔功能层在囊袋外部，大孔支撑层贴合在功能层内侧作为“骨架”，最终得到整体直径为2cm，内腔直径为1.5cm，功能层孔径为80nm-2μm，支撑层孔径为1mm的细胞囊袋。本实施例中细胞封装囊袋的整体模型示意图如图1所示；细胞封装囊袋的剖面模型示意图如图2所示；细胞封装囊袋的细胞注入方式如图3所示；细胞封装囊袋的功能示意图如图4所示；细胞封装囊袋的外部功能层的场发射扫描电镜图如图13所示；细胞封装囊袋的内部支撑层模型如图14所示；细胞封装囊袋的内部支撑层的实物图如图15所示。
87.实施例3
88.一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其结构为：
89.(1)由多孔聚氨酯薄膜构成细胞封装囊袋的外部功能层，孔径在8μm-25μm，厚度20μm；(2)利用3d打印作为细胞封装囊袋的内部支撑层，孔为1mm
×
1mm，厚度100μm；(3)利用热熔的方式封合，构建细胞囊袋；(4)在移植前，将血管内皮生长因子(vegf)与细胞共混。
90.本实例中，利用孔径在8μm-25μm不等的多孔聚氨酯膜作为其功能层，相比于实例1、实例2，孔径更大，渗透率更佳，细胞所需营养物质可以更加有效地进行交换；另一方面，大分子也具有较高的截留性可以阻隔免疫细胞、介导内部细胞死亡的细胞因子的进入，达到免疫隔离的作用。在移植前加入内皮生长因子(vegf)与细胞共混，使细胞在植入体内前
期可快速产生血管，以避免移植前期缺氧死亡。
91.本实例中的外部功能层的多孔聚氨酯薄膜通过以下方法制备得到：铸膜液体系为聚氨酯/聚乙烯吡咯烷酮/n,n
′‑
二甲基甲酰胺，聚氨酯(mn＝60000),聚乙烯吡咯烷酮(mn＝8000)。本实例中总固含量为50％，其中聚乙烯吡咯烷酮占比90％。配制40g的溶液体系，称取2g聚氨酯，18g聚乙烯吡咯烷酮于100ml单口烧瓶中，再加入20g n,n
′‑
二甲基甲酰胺，60℃下磁力搅拌6h，待完全溶解后，转移到聚四氟乙烯瓶中待用。配制凝固浴体系，n,n
′‑
二甲基甲酰胺与去离子水体积比20∶80，即1.5l体系中，加入300ml n,n
′‑
二甲基甲酰胺于不锈钢盘中，再加入1200ml去离子水，混匀待用。本实例中，铸膜液在60℃下铺膜，将2ml上述配制好的铸膜液滴加到玻璃基板上，250μm铺膜器刮膜，立即放入上述提前配置好的凝固浴中，5分钟后，待铸膜液溶液完全沉淀成膜，从凝固浴中取出放置在硫酸纸上，烘干。
92.本实施例中外部功能层和内部支撑层的封合方式与实施例2相同。最终得到整体直径为2cm，内腔直径为1.5cm，功能层孔径为8μm-25μm，支撑层孔径为1mm的细胞囊袋。
93.本实施例中细胞封装囊袋的整体模型示意图如图1所示；细胞封装囊袋的剖面模型示意图如图2所示；细胞封装囊袋的细胞注入方式如图3所示；细胞封装囊袋的功能示意图如图4所示；细胞封装囊袋的外部功能层的场发射扫描电镜图如图16所示；细胞封装囊袋的内部支撑层模型如图14所示；细胞封装囊袋的内部支撑层的实物图如图15所示。
94.实施例4
95.渗透截留性能测试：
96.附图8根据图21自制装置进行渗透截留测试。将实施例1～3制备的细胞囊袋功能层膜和对照组商业滤膜pes(0.22μm)用两片挖空的硅橡胶片夹持，再用厚硅橡胶片获得两个溶液池，一侧加入渗透液，另一侧为透过液，外部用四个夹子夹持以保证其致密性。进行大中小分子量物质自由扩散的测试，将透过液池的溶液进行紫外分光光度计法测量得到膜对三种物质的渗透浓度，经过计算得到膜对这三种物质在一定时间一定温度下的渗透率，即得到图8的渗透结果。商业滤膜pes(0.22μm)菊糖(6179.36da)37℃，1h透过率为39.9
±
4.1％；溶菌酶(14307da)37℃，1h透过率为7.3
±
1.0％；牛血清白蛋白(66.446kda)37℃，12h透过率为56.18
±
1.0％，截留率不到一半。实施例1中的功能层菊糖37℃，1h透过率为62.8
±
1.8％；溶菌酶37℃，1h透过率为8.4
±
1.2％；牛血清白蛋白37℃，12h透过率为1.9
±
0.7％，对大分子12h截留率达到98％。实施例2中的功能层菊糖37℃，1h透过率为79.5
±
0.5％；溶菌酶37℃，1h透过率为16.6
±
1.6％；牛血清白蛋白37℃，12h透过率为17.6
±
5.2％。实施例3中的功能层菊糖37℃，1h透过率为88.4
±
3.5％；溶菌酶37℃，1h透过率为24.1
±
6.2％；牛血清白蛋白37℃，12h透过率为37.9
±
5.4％。经过渗透实验可知，实施例1-3制备的功能层可截留大分子蛋白质即牛血清白蛋白(66.43kda)，对分子量6179da的菊糖也有较高的透过率。
97.实施例5
98.生物相容性测试：(细胞在功能层上培养)
99.(1)细胞增殖测试：将实施例1、2、3的功能层置于48孔板中，每孔以1
×
104的密度将l929细胞接种在材料表面，空白组做对照。培养1，3，5，7天后，将含有10％cck-8溶液的培养基加入孔板，孵育两小时，然后取100ul培养基加入96孔板，用酶标仪测试培养基在450nm处的吸光度(见图17)。
100.(2)活死染测试：细胞在材料上培养3d后，用pbs冲洗2遍，参考试剂盒(calcein-am/pi double staining kit，型号：c542，厂商：同仁化学)的操作步骤，进行细胞活死染，15min后，吸走染液，pbs轻轻洗涤2遍，用倒置荧光显微镜拍照。(见图18)
101.图17为实施例1、2、3细胞囊袋功能层的细胞增殖图，结果表明其具有良好的生物相容性，有利于细胞增殖。
102.图18为实施例1、2、3细胞囊袋功能层的细胞活死染图，看观察出视野范围内几乎无死细胞，结果辅证图17，具有良好的生物相容性。
103.实施例6
104.封装囊袋内细胞活性测试：
105.将200μl内含50000个l929细胞的细胞悬液先用1ml注射器吸取，再通过囊袋的导管注入到囊袋内，再将导管口封严。以致密膜细胞囊袋为对照。培养1、3、5、7、14、30天，再采取上述细胞增殖、活死染测试方法进行内部细胞的活性测试。
106.图19为实施例1、2细胞囊袋内部细胞的增殖图，从实验结果来看，致密膜封装囊袋内细胞24h内缺氧死亡，实施例1、2内部细胞具有良好的增殖活性，达到了内部细胞装载培养的目的。
107.图20为实施例1、2细胞囊袋内部细胞的细胞活死染图，可观察出致密膜封装囊袋视野范围内无活细胞，实施例1、2内部细胞具有良好的活性。
108.注：实施例3由于孔径过大，出现囊袋内细胞泄露情况。
109.对比例1
110.致密膜细胞囊袋制备方法：
111.配制15wt％的pu/dmf溶液，铺膜器250μm以玻璃板为基底铺膜，自然风干成膜，囊袋的封合方法与实施例1一致。
112.最后说明：上述实施例为本发明的优选实施例而已，但是本发明的实施方式不受上述实例限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均为等效。

技术特征：

1.一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其特征在于，包括外部功能层和内部支撑层，将两张外部功能层夹持两张内部支撑层，所述内部支撑层贴合在外部功能层内侧，再将外部功能层、内部支撑层边缘封合得到所述细胞封装囊袋；所述外部功能层为多孔半透膜，孔径为20nm～30μm。2.根据权利要求1所述的一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其特征在于，所述封装囊袋直径为2cm～5cm，内腔直径为1cm～1.5cm；所述外部功能层厚度为0.1μm～50μm，孔径为40nm～25μm，所述内部支撑层厚度为10μm-100μm，孔径为10μm～1mm。3.根据权利要求1所述的一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其特征在于，所述外部功能层组成为聚氨酯，聚醚砜，聚己内酯，聚乳酸，聚对苯二甲酸乙二醇酯聚乳酸中的一种或两种以上；所述内部支撑层组成为聚氨酯，聚己内酯，聚醚砜，聚乳酸，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸、聚四氟乙烯中的一种或两种以上；所述外部功能层和内部支撑层材料相同或不同。4.根据权利要求1所述的一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋，其特征在于，所述细胞封装囊袋还包括一根导管，所述导管前端0.3cm～0.5cm深入囊袋内部，并在此处与内部支撑层和外部功能层边缘封合。5.一种制备权利要求1～3任一项所述免疫隔离细胞封装囊袋的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)非溶剂诱导相分离的方法制备外部功能层；(2)制备具有一定支撑性的片层支架作为内部支撑层；(3)将两张外部功能层薄膜夹持两张内部支撑层再将边缘封合，得到免疫隔离细胞封装囊袋。6.根据权利要求5所述的孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述非溶剂诱导相分离的方法具体如下：将外部功能层原料、致孔剂、溶剂配置成均相铸膜液，将铸膜液滴加在玻璃基板上用铺膜器刮膜，放入凝固浴中沉淀成膜，取出并烘干得到外部功能层；所述铸膜液总固含量为10-50wt％，所述致孔剂占总固含量的20％-90％，致孔剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇的一种或其混合；所述溶剂为n,n
′‑
二甲基甲酰胺，n,n
′‑
二甲基乙酰胺，氮甲基吡咯烷酮，二甲基亚砜，四氢呋喃其中的一种或其混合；所述凝固浴为纯水，纯乙醇，水和溶剂的混合液，乙醇和溶剂的混合液，其中水或乙醇与溶剂的体积比为65∶35-90∶10；所述铺膜厚度为25-500μm，铺膜温度为4-60℃；步骤(2)所述制备内部支撑层的方法为致孔剂致孔铺膜、添加致孔剂旋涂、3d打印或静电纺丝中的一种。7.根据权利要求6所述的孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮分子量为6000～10000，所述外部功能层原料分子量为50000～100000；
步骤(3)所述的封合方式为直接热封或溶剂封或导丝加热封合。8.根据权利要求5所述的孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述封合时，还将一根导管前端0.3～0.5cm深入囊袋内，并在此处与内部支撑层和外部功能层封合；所述导管内径为0.5～0.7mm，外径为1～1.5mm，长为3～5cm。9.权利要求1～4任一项所述的孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋在制备人工细胞中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在细胞移植前进行预血管化处理，所述预血管化处理为在移植前注入细胞时加入血管内皮生长因子、血管生成素，肝素。

技术总结

本发明属于组织工程支架技术领域，公开了一种孔径可控的免疫隔离细胞封装囊袋及其制备方法与应用，该细胞封装囊袋包括外部功能层和内部支撑层，将两张外部功能层夹持两张内部支撑层，所述内部支撑层贴合在外部功能层内侧，再将外部功能层、内部支撑层边缘封合得到，外部功能层为多孔半透膜，孔径为20nm～30μm。利用非溶剂诱导相分离方法制备外部功能层，制备具有一定支撑性的片层支架作为内部支撑层，再通过溶剂封合或热封的方式封合。本发明工艺简单，成本低廉，易工业化商品化，可获得不同孔径大小的细胞封装囊袋，该囊袋具有良好的生物相容性，培养30天后封装囊袋内细胞仍保持良好增殖活性。增殖活性。增殖活性。