(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911016676.9
(22)申请日 2019.10.24
(71)申请人 华东理工大学
地址 200237 上海市徐汇区梅陇路130号
(72)发明人 高峰 陈显军 杨弋 赵玉政
贺牧野 陈彦佐 徐嘉俊
扎娜·艾特·巴希尔 侯昕宇
寿晨汀 王研 蔡晓然 程驿
张苗 王杰 丁芷瑄 汪晓蕾
孙余吉 王艳兵 孙锐 吕英妮
孙玲娜 殷语 边依真 陈泽坤
张满湛
(74)专利代理机构 上海顺华专利代理有限责任
公司 31203
代理人 李鸿儒 程意意
(51)Int.Cl.A61K 47/69(2017.01)A61K 38/16(2006.01)A61K 48/00(2006.01)A61K 47/60(2017.01)A61K 41/00(2020.01)A61P 35/00(2006.01)B82Y 5/00(2011.01)B82Y 30/00(2011.01)B82Y 20/00(2011.01)B82Y 40/00(2011.01)
(54)发明名称
(57)摘要
体复合物，由阳离子脂质体以及其包裹的壳聚糖
与质粒DNA组成，其中，阳离子脂质体由阳离子磷
脂DOTAP，中性磷脂HSPC或EPC，辅助磷脂DOPE，胆
固醇Chol以及功能性磷脂DSPE ‑PEG 2000‑X或
DOPE ‑PEG 2000‑X所构成，所述质粒DNA为重组光敏
转录因子表达基因及白喉毒素A片段(DT ‑A)转录 单元；光控表达白喉毒素的质粒DNA先由壳聚糖
压缩后，包载进阳离子脂质体中，阳离子脂质体
的表面可修饰各种基团，使该递药系统具有一定
的靶向作用，
用于恶性肿瘤的效果良好。权利要求书1页 说明书4页 附图8页CN 112704742 A 2021.04.27
C N 112704742
A
1.一种用于恶性肿瘤的包载质粒的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述的复合物由阳离子脂质体以及其包裹的壳聚糖与质粒DNA组成，其中，阳离子脂质体由阳离子磷脂DOTAP，中性磷脂HSPC或EPC，辅助磷脂DOPE，胆固醇Chol以及功能性磷脂DSPE -PEG 2000-X 或DOPE -PEG 2000-X所构成，所述质粒DNA为重组光敏转录因子表达基因及白喉毒素A片段(DT -A)转录单元；是通过以下方法制备而成的：
1)将壳聚糖储备液与质粒DNA储备液在pH＝7.4的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液中相混合，涡旋数秒后，在室温下静置15min即得到壳聚糖与质粒DNA的复合物，其中，壳聚糖与质粒DNA的氮磷比为2.5-10；
2)将DOTAP，HSPC或EPC，DOPE，Chol，DSPE -PEG 2000-X或DOPE -PEG 2000-X充分溶解在氯仿与甲醇的混合溶剂中；其中，中性磷脂HSPC或EPC占所有磷脂材料的摩尔比为30％-50％，阳离子磷脂DOTAP占所有磷脂材料的摩尔比为10％-30％，DOPE与DOTAP的摩尔比为0.8-1.2，胆固醇Chol占所有磷脂材料的摩尔比为30％-50％，功能性磷脂DSPE -PEG 2000-X或DOPE -PEG 2000-X占所有磷脂材料的摩尔比为2.5％-5％，
功能性磷脂DSPE -PEG 2000-X或DOPE -PEG 2000-X中X为甲氧基或靶向基团，靶向基团选自cRGD肽、叶酸、转铁蛋白、茴香酰胺中的一种或几种；
3)将步骤2)的混和溶液通过减压旋蒸的方式除去有机溶剂，使之形成均匀的薄膜，并用高压氮气吹尽残余的有机溶剂；
4)在步骤3)形成的薄膜中加入含有步骤1)制备的壳聚糖-质粒DNA复合物的pH＝7.4的HEPES缓冲液，使壳聚糖与阳离子脂质体的总浓度为10-20mg/mL，摇晃至薄膜完全被水化，形成乳白混合液，并进行水化孵育，其中，阳离子脂质体与质粒DNA的氮磷比为1-5；
5)将步骤4)中水化后的混合液在冰浴中进行探头超声，得到含有乳光的透明液体，再通过200nm孔径挤出器挤出15-25次，即得所述包载质粒的阳离子脂质体复合物。
2.如权利要求1所述的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述步骤1)中壳聚糖的分子量为30kDa -110kDa，壳聚糖与质粒DNA的氮磷比为3。
3.如权利要求1所述的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述步骤2)中氯仿与甲醇的体积比为8:1。
4.如权利要求1所述的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述步骤4)中的水化孵育，如使用EPC水化孵育，温度为40-50℃，如使用HSPC水化孵育，温度为55-65℃。
5.如权利要求1所述的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述步骤4)中阳离子脂质体与质粒DNA的氮磷比为4。
6.如权利要求1所述的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述步骤5)中探头的超声功率为100W，超声时间为5-15min。
权 利 要 求 书1/1页CN 112704742 A
一种用于恶性肿瘤的包载质粒的阳离子脂质体复合物
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于恶性肿瘤的包载质粒的阳离子脂质体复合物，具体涉及一种包载光控表达白喉毒素质粒DNA的长循环(靶向)阳离子脂质体，可以用于恶性肿瘤的，属于生物医药技术领域。
背景技术
[0002]恶性肿瘤作为全球范围内引起死亡的重要因素之一，已经成为影响人类健康的第二大疾病。白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)作为白喉棒状杆菌分泌产生的一种毒素，白喉毒素A片段(DTA)具有极强的毒性，能够通过催化NAD+上的ADP核糖基向延展因子-2 (Elongation factor-2，EF-2)转移，进而抑制细胞的蛋白质合成。由于化疗等传统方法易产生耐药性等缺陷，DT借助于其强大的细胞毒性在肿瘤疾病的研究中崭露头角，临床试验亦显示了其对化疗耐药性和难治愈的癌症具有明显的抗肿瘤活性。
[0003]利用DT进行肿瘤时需要解决的关键问题在于如何精准地将DT作用于肿瘤病灶部位，而不对正常组织产生毒性。对此，目前主要有两种应对的解决方案，一是在DTA蛋白分子上偶联配体构建成具有一定靶向作用的免疫毒素；二是构建能表达DTA的质粒DNA (pDNA)，并编码入对肿瘤环境响应的启动子，以达到在肿瘤细胞内转录表达DTA的目的，从而对肿瘤细胞进行杀伤。然而，上述解决方案仍存在着剂量依赖的非特异性或对正常细胞的损害。白喉毒素基因光控基因系统利用光作为外源性诱导剂，能够精准地在所需时间和空间上控制基因的表达。该系统由一个光调控的转录因子和含有DTA基因的转录单元构成，具有诱导表达效率高、背景低、激活快、表达量可调节等普通诱导表达系统也有的优点，能够在时间和空间上精确、可逆地控制目标基因的表达水平。
[0004]质粒DNA极易被血液中的核糖核酸酶所降解，为了有效地将光控白喉毒素质粒DNA 递送至肿瘤病灶区域，我们设计了一种包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物。质粒DNA将先由具有良好生物相容性的壳聚糖进行压缩，再与阳离子脂质体混合，形成三元复合物。阳离子脂质体由多种磷脂构成，其中，阳离子磷脂DOTAP赋予载体正电荷用于包载质粒，辅助磷脂DOPE用于提高转染效率，中性磷脂HSPC/EPC在一定程度上能分散载体的正电荷用以降低阳离子脂质体本身的毒性，胆固醇Chol可以使脂质体的结构更加稳定，功能性磷脂DSPE-PEG2000-X或DOPE-PEG2000-X可以防止载体被血液中的血浆蛋白所吸附，提高载体在体内的循环时间，此外，通过修饰靶向基团还能使载体具有主动靶向的功能。阳离子脂质体包载光控白喉毒素质粒DNA后，通过被动/主动靶向至肿瘤区域并被肿瘤细胞摄取，在
外部蓝光的照射下，质粒转录表达DTA从而杀伤肿瘤细胞，是一种基于DTA的安全、可控肿瘤策略。
发明内容
[0005]针对目前DTA的局限性，本发明制备了包裹光控表达白喉毒素A片段质粒DNA 的阳离子脂质体复合物，在脂质体的表面修饰PEG以达到在体内长循环的目的，此外，亦可通过修饰靶向基团使载体主动靶向至肿瘤区域，来提高肿瘤效率。
[0006]本发明的目的是制备一种包裹光控表达白喉毒素质粒DNA的阳离子脂质体复合物，该复合物被肿瘤细胞摄取后，由蓝光作为转录开关调控DTA的表达，进而使DTA用于肿瘤的方式更加安全、可控，通过以下技术方案实现：
[0007]一种用于恶性肿瘤的包载质粒的阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述的复合物由阳离子脂质体以及其包裹的壳聚糖与质粒DNA组成，其中，阳离子脂质体由阳离子磷脂DOTAP，中性磷脂HSPC或EPC，辅助磷脂DOPE，胆固醇Chol以及功能性磷脂DSPE-PEG2000-X或DOPE-PEG2000-X所构成，所述质粒DNA为重组光敏转录因子表达基因及白喉毒素A片段(DT-A)转录单元；是通过以下步骤制备而成的：
[0008]1)将壳聚糖储备液与质粒DNA储备液在pH＝7.4的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中相混合，涡旋数秒后，在室温下静置15min即得到壳聚糖与质粒DNA的复合物，其中，壳聚糖与质粒DNA的氮磷比为2.5-10；
[0009]2)将DOTAP，HSPC或EPC，DOPE，Chol，DSPE-PEG2000-X或DOPE-PEG2000-X充分溶解在氯仿与甲醇的混合溶剂中；其中，中性磷脂HSPC或EPC占所有磷脂材料的摩尔比为30％-50％，阳离子磷脂DOTAP占所有磷脂材料的摩尔比为10％-30％，DOPE与DOTAP的摩尔比为0.8-1.2，胆固醇Chol占所有磷脂材料的摩尔比为30％-50％，功能性磷脂DSPE-PEG2000-X或DOPE-PEG2000-X占所有磷脂材料的摩尔比为2.5％-5％，
[0010]功能性磷脂DSPE-PEG2000-X或DOPE-PEG2000-X中X为甲氧基或靶向基团，靶向基团选自cRGD肽、叶酸、转铁蛋白、茴香酰胺中的一种或几种；
[0011]3)将步骤2)的混和溶液通过减压旋蒸的方式除去有机溶剂，使之形成均匀的薄膜，并用高压氮气吹尽残余的有机溶剂；
[0012]4)在步骤3)形成的薄膜中加入含有步骤1)制备的壳聚糖-质粒DNA复合物的pH＝7.4的HEPES缓冲液，使壳聚糖与阳离子脂质体的总浓度为10-20mg/mL，摇晃至薄膜完全被水化，形成乳白混合液，并进行水化孵育，其中，阳离子脂质体与质粒DNA的氮磷比为1-5；[0013]5)将步骤4)中水化后的混合液
在冰浴中进行探头超声，得到含有乳光的透明液体，再通过200nm孔径挤出器挤出15-25次，即得所述包载质粒的阳离子脂质体复合物。[0014]所述步骤1)中壳聚糖的分子量为30kDa-110kDa。
[0015]所述步骤1)中壳聚糖与质粒DNA的氮磷比优选为3。
[0016]所述步骤2)中氯仿与甲醇的体积比为8:1。
[0017]所述步骤4)中的水化孵育，如使用EPC水化孵育，温度为40-50℃，如使用HSPC水化孵育，温度为55-65℃。
[0018]所述步骤4)中阳离子脂质体与质粒DNA的氮磷比优选为4。
[0019]所述步骤5)中探头的超声功率为100W，超声时间为5-15min，优选为10min。[0020]本发明的优点：制备了一种包裹光控表达白喉毒素质粒DNA的阳离子脂质体复合物，通过将纳米递送系统与光控基因表达系统相结合，使基于DTA的肿瘤变得更为可控、安全。
附图说明：
[0021]包载绿荧光蛋白质粒且未经过靶向基团修饰的复合物记为pEGFP@CL；包载绿荧光蛋白质粒且经过cRGD靶向基团修饰的复合物记为pEGFP@cRGD-CL；包载光控表达白喉
毒素质粒且未经过靶向基团修饰的复合物记为pDNA@CL；包载光控表达白喉毒素质粒且经过cRGD靶向基团修饰的复合物记为pDNA@cRGD-CL。
[0022]图1-A为壳聚糖与质粒DNA复合后的琼脂糖凝胶电泳图，从图中可知当氮磷比大于等于1时，壳聚糖能够完全包载住质粒DNA；图1-B为DNA排斥实验，壳聚糖与质粒DNA复合后溴化乙锭无法与DNA充分结合，表现出荧光强度减弱，从图中发现当壳聚糖与质粒DNA的氮磷比大于等于2.5时，荧光强度减弱的趋势放缓，过少的壳聚糖无法有效压缩质粒DNA，而过多的壳聚糖会使两者结合地过于紧密，无法有效释放出质粒DNA，影响转染效率吧，因此需要选择合适的氮磷比进行壳聚糖与质粒DNA的压缩。
[0023]图2-A为不同氮磷比情况下阳离子脂质体与壳聚糖质粒DNA复合物的粒径与电位，可以发现，当阳离子脂质体与质粒DNA的氮磷比为3时，复合物的粒径最小；图2-B为氮磷比为3时阳离子脂质体与质粒DNA复合物的粒径分布图，复合物粒径为171.9±2.1nm，分布较为均一；图2-C为氮磷比为3时阳离子脂质体与质粒DNA复合物的电镜图，可以发现复合物呈现较为均整的球形结构。
[0024]图3为包载增强型绿荧光蛋白质粒(pEGFP)的各载体在B16F10黑素瘤细胞中的转染情况，通过流式转染效率的定量分析，可以发现，各组载体均能成功在B16F10细胞中进行表达绿荧光蛋白，成功转染，当在阳离子脂质体表面修饰cRGD后，由于其被B16F10细胞摄取更多，因而其转染效率也会有所提高，几乎与市售的Lipofectamine2000一致(n＝3，**表示p<0.01)。
[0025]图4-A与图4-B为包载光控白喉毒素质粒的阳离子脂质体复合物在不同蓝光照射强度下对B16F10细胞的毒性，结果显示，当没有蓝光照射时，复合物几乎不会产生细胞毒性，而一旦在蓝光照射下，光控白喉毒素质粒能够在细胞内转录表达白喉毒素，从而杀伤细胞；图4-C为包载光控白喉毒素质粒的阳离子脂质体复合物对B16F10细胞产生的凋亡作用，与细胞毒性实验类似，只有在蓝光照射下复合物才会对细胞产生凋亡作用(n＝3，*表示p< 0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001)。
[0026]图5为ELISA试剂盒检测B16F10经光照转染后DTA的表达情况，可以发现，无论有无cRGD修饰，两者均能成功在细胞内表达DTA并杀伤细胞，这一部分DTA在细胞死亡后泄露到上清液中；另外，通过收集细胞并破碎后，发现在细胞内经由cRGD修饰组表达的DTA更多，结论与凋亡实验类似(n＝3，*表示p<0.05，***表示p<0.001)。
[0027]图6为包载Cy5标记的质粒的脂质体复合物在荷瘤小鼠中的分布情况与体内肿瘤靶向能力。为了避免B16F10黑素瘤对荧光信号产生干扰，我们使用了人源A375黑素瘤细胞株进行荷瘤小鼠模型建立，该细胞株也被报导为整合素受体高表达。通过对各组织的荧光强度进行定量后可以发现，在四个不同时间点，肿瘤病灶区域均有载体信号产生，并且经过cRGD修饰的载体相较于未修饰组更易在肿瘤部位蓄积，这主要是由于cRGD能够与肿瘤部位高表达的整合素受体相结合，从而介导载体更多地被肿瘤细胞摄取。除此之外，我们发现在尾静脉给药1h后，载体便逐渐在肿瘤部位累计，8h左右达到最强信号，到24h肿瘤部位信号逐渐减弱，这在一定程度上提示我们进行蓝光照射的时间应当主要集中于给药
后的24h内。
[0028]图7-A在原位C57/BL小鼠荷B16F10模型中，每三天一次尾静脉注射包载光控表达白喉毒素质粒的阳离子脂质体复合物，在蓝光照射下的肿瘤相对体积变化曲线，可以发现
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