(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011220791.0
(22)申请日 2020.11.05
(71)申请人 新疆师范大学
地址 830054 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐
市沙依巴克区新医路102号
(72)发明人 赵惠新 赵和平 谢尔瓦尼木
林荣荣
(74)专利代理机构 西安亚信智佳知识产权代理
事务所(普通合伙) 61241
代理人 段国刚
(51)Int.Cl.
A61K 38/12(2006.01)
A61P 35/00(2006.01)
C12P 21/04(2006.01)
C07K 7/56(2006.01)
C12R 1/125(2006.01)
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明公开了一种抗霉枯草菌素
(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用，
采用分离自新疆和硕境内连作棉田，经冬季低温自
然冻封后的棉花根际土壤的枯草芽孢杆菌
(B a c i l l u s s u b t i l i s )的抗霉枯草菌素
(Mycosubtilin)，经提取、纯化和鉴定，抗霉枯草
菌素(Mycosubtilin)的分子式为：C 51H 80N 12O 14，
相对分子质量为1084.38，将其应用于制备抗肿
瘤药物中，抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在体外
都有很好的杀伤作用，其半致死浓度均在4‑
20mg/L；采用灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌
肿瘤效果显著，其中剂量为3mg/kg时，腹腔注射，
抑瘤率达80％以上；同时抗枯草菌素与DDP抗癌
药物达到相同效果的基础上，抗枯草菌素产
生的副作用小，对小鼠体重增长的抑制作用显著
低于DDP，
可以作为一种潜在的抗肿瘤药物应用。权利要求书1页 说明书6页 附图6页CN 112316111 A 2021.02.05
C N 112316111
A
1.一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.一种在制备抗肿瘤药物中应用的抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于装有5mL NB培养液的试管中，并在37℃、180r ·min -1下振荡培养12h，得种子液；
(2)将步骤(1)中所得种子液以以体积比1:10接种于含有发酵培养基的三角瓶中，并在37℃、180r ·min -1
下振荡培养18-36h，得发酵液，用抽滤法去除菌体，收集无菌发酵液。
(3)将浓盐酸加入步骤(2)所得无菌发酵液，调节pH值至2.0，于4℃静置10h，离心后取沉淀，得到粗提物浸膏。
(4)将步骤(3)所得粗提物浸膏用20mL正丁醇充分溶解，然后离心去除不溶性杂质，对上清液进行半制备液相纯化，获得抗霉枯草菌素。
3.如权利要求1所述一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的分子式为C 51H 80N 12O 14，相对分子质量为108
4.38，
结构式为：
4.如权利要求1所述的一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗霉枯草菌素可在制备肝癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌的抗肿瘤药物中应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 112316111 A
一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物与新医药技术领域，特别涉及一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002]“癌症”，指恶性肿瘤，具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。因病因不清，困难，几个世纪以来，癌症像幽灵一般死死地纠缠着人类，每年要吞噬数百万人的生命。目前，根据患者的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围等，主要采用手术、化疗、放疗、免疫等手段癌症。手术绝大多数早期肿瘤的首选方法，虽然疗效直接，但对于中晚期病例风
险极高，且对于部位敏感的肿瘤，如脑肿瘤等，即便是早期，手术成功率也很低。化疗亦是癌症的常用方法之一，但目前化疗所用的药物副作用很大，放疗一般需配合手术，虽然对肿瘤具有较好的疗效，但在杀伤肿瘤细胞的同时，也会杀伤人体内的正常细胞，导致免疫系统功能受损。靶向是近年来癌症较为新兴的一个方式，其目的明确、副作用小，对于一些敏感性强的患者，控制癌症发展的效果良好，但不是所有的癌症患者都适合用靶向，只适用于一些体内存在基因突变的患者，而对大多数患者无效。目前，临床上使用的抗癌药物多为人工合成类药物，还缺乏疗效好、副作用小的药物。
[0003]目前报道芽孢杆菌属(Bacillus)革兰氏阳性杆菌菌株可以分泌多种环脂肽类化合物，其中部分环脂肽类物质具有较好的抗菌活性物质，比如表面活性素(Surfactin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰源素(fengycin)等。这些环脂肽类化合物主要由肽段和脂肪酸链组成环状结构，在芽孢杆菌内通过非核糖体途径合成，作为次级代谢产物排出菌体体外。这类物质分子量较低，现有研究表明，环脂肽类物质主要具有抗菌、抗炎、抗病毒等生物学功能。其中有关伊枯草菌素、芬介素、杆菌霉素、表面活性剂等环脂肽类物质抑癌功能均有报道，但未见抗霉枯草菌素抗癌功能和应用的报道。抗霉枯草菌素为伊枯草菌素同系物，抗霉枯草菌素环肽结构中的八个氨基酸残基中有两个与伊枯草菌素序列不同，在性质上较伊枯草菌素更稳定，在抗真菌活性上比伊枯草菌素更强。
发明内容
[0004]本发明针对伊枯草菌素性质不稳定，且尚未见有文献报道和披露抗霉枯草菌素在抗肿瘤方面应用的报道。本发明旨在于提供一种抗霉枯草菌素在抗肿瘤方面应用，本发明采用分离自枯草芽孢杆菌的抗霉枯草菌素，通过化合物的提取、纯化和鉴定，抗霉枯草菌素的分子式为：C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，将该化合物应用于制备抗肿瘤的药物中，抗霉枯草菌素在体外对肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞都有很好的杀伤所用，其半致死浓度均在4-20mg/L；采用灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌肿瘤都有很好的效果，其中3mg/kg剂量腹腔注射，抑瘤率达80％以上。
[0005]为了达到以上技术目的，本发明通过以下技术方案实现：
[0006]本发明提供一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0007]同时本发明提供一种在制备抗肿瘤药物中应用的抗霉枯草菌素的提取方法，包括如下步骤：
[0008](1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于装有5mL NB培养液的试管中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养12h，得种子液；
[0009](2)将步骤(1)中所得种子液以以体积比1:10接种于含有发酵培养基的三角瓶中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养18-36h，得发酵液，用抽滤法去除菌体，收集无菌发酵液。[0010](3)将浓盐酸加入步骤(2)所得无菌发酵液，调节pH值至2.0，于4℃静置10h，离心后取沉淀，得到粗提物浸膏。
[0011](4)将步骤(3)所得粗提物浸膏用20mL正丁醇充分溶解，然后离心去除不溶性杂质，对上清液进行半制备液相纯化，获得抗霉枯草菌素。
[0012]所述抗霉枯草菌素的分子式为C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，结构式为：
[0013]
[0014]所述抗霉枯草菌素可在制备肝癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌等的抗肿瘤药物中应用。
[0015]本发明中，采用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)株为农业部允许使用的无害安全菌株，可于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)等公共渠道购买，普通技术人员可以通过公众渠道获得，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)培养采用公知的培养基和培养方法，本发明采用的菌种分离自新疆和硕连作棉田根际土壤，该菌种于2017年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC No：M2017309。
[0016]采用上述技术方案后，本发明获得有益效果如下：
[0017](1)抗霉枯草菌素在体外对肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞都有很好的杀伤所用，其半致死浓度均在4-20mg/L。且通过体内试验表明，灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌肿瘤都有很好的效果，其中3mg/kg剂量腹腔注射，抑瘤率达80％以上。[0018](2)本发明提供的抗枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用，抗枯草菌素与DDP抗癌药物达到相同效果的基础上，抗枯草菌素产生的副作用小，对小鼠体重增长的抑制作用显著低于DDP，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物应用。
附图说明：
[0019]图1抗霉枯草菌素分子结构字母式简图。
[0020]图2抗霉枯草菌素分子结构线条式简图。
[0021]图3为不同浓度抗霉枯草菌素对鼠源肝癌细胞H22致死作用。
[0022]图4为不同浓度抗霉枯草菌素对人源肝癌细胞Bel7404致死作用图。
[0023]图5为抗霉枯草菌素引起鼠源肝癌细胞H22凋亡的流式细胞检测象限图，图中，a抗霉枯草菌素浓度为0μg/mL、b抗霉枯草菌素浓度为10μg/mL、c抗霉枯草菌素浓度为20μg/mL、d抗霉枯草菌素浓度为40μg/mL、e抗霉枯草菌素浓度为50μg/mL、f抗霉枯草菌素浓度为100μg/mL。
[0024]图6为抗霉枯草菌素引起人源肝癌细胞Bel7404凋亡的流式细胞检测象限图，图中，a抗霉枯草菌素浓度为0μg/mL、b抗霉枯草菌素浓度为10μg/mL、c抗霉枯草菌素浓度为20μg/mL、d抗霉枯草菌素浓度为40μg/mL、e抗霉枯草菌素浓度为50μg/mL、f抗霉枯草菌素浓度为100μg/mL。
[0025]图7为腹腔注射不同剂量抗霉枯草菌素对小鼠肝癌肿瘤抑制作用图。
[0026]图8为腹腔注射不同剂量抗霉枯草菌素对小鼠肝癌肿瘤抑制作用统计图。[0027]图9为腹腔注射不同剂量抗霉枯草菌素对荷瘤(肝癌)小鼠体重的影响图。[0028]图10为不同浓度抗霉枯草菌素对人源宫颈癌细胞Hela致死作用图。
[0029]图11为不同浓度抗霉枯草菌素对人源肺癌细胞A549致死作用图。
[0030]图12为不同浓度抗霉枯草菌素对人源结肠癌细胞Sw480致死作用图。
具体实施方式
[0031]下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。
[0032]本发明中选用的所有材料、实际和仪器的测定方法都为本领域熟知的但不限制本发明的实施例，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可以适用于本发明以下实施方式的实施。
[0033]实施例1：抗霉枯草菌素的制备
[0034]一种在抗肿瘤中应用的抗霉枯草菌素的提取方法，具体包括如下步骤：
[0035](1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于装有5mL NB培养液的试管中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养12h，得种子液；
[0036](2)将步骤(1)中所得种子液以以体积比1:10接种于含有发酵培养基的三角瓶中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养18-36h，得发酵液，用抽滤法去除菌体，收集无菌发酵液。[0037](3)将浓盐酸加入步骤(2)所得无菌发酵液，调节pH值至2.0，于4℃静置10h，离心后取沉淀，得到粗提物浸膏。
[0038](4)将步骤(3)所得粗提物浸膏用20mL正丁醇充分溶解，然后离心去除不溶性杂质，对上清液进行半制备液相纯化，获得抗霉枯草菌素。
[0039]将充分干燥的抗霉枯草菌素用500～600uL氘代丙酮溶解，完全溶解后转移至核磁管内密封，用于测试1H-NMR和13C-NMR核磁共振波谱，核磁谱的测定由北京师范大学代为测定完成。
[0040]从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中提取并分离了抗霉枯草菌素，经过进一
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