(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910717591.7
(22)申请日 2019.08.05
CGMCC No.17980 2019.06.19
(71)申请人 海南大学
地址 570228 海南省海口市人民大道58号
(72)发明人 刘铜 薛鸣 陈迪 刘震 侯巨梅
邢梦玉
(74)专利代理机构 哈尔滨东方专利事务所
23118
代理人 曹爱华
(51)Int.Cl.
C12N 1/14(2006.01)
A01N 63/04(2006.01)
A01P 3/00(2006.01)
A01P 21/00(2006.01)C12R 1/885(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及的是哈茨木霉HL119及其应用，
这株哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119，
该菌株的保藏编号为CGMCC No.17980。本发明所
促进作为根部生长以及防治植物病原菌所导致
的病害的效果，这株哈茨木霉HL119对番茄灰霉
85%。权利要求书1页 说明书8页序列表1页 附图1页CN 110272833 A 2019.09.24
C N 110272833
A
1.一株哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119，该菌株的保藏编号为CGMCC No. 17980。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119，其特征在于：所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119的几丁质酶活性为0.8867U/ml。
3.一种权利要求1或2所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119用于促进农作物根部生长。
4.一种权利要求1或2所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119的应用，其特征在于：哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119用于促进种子萌发。
5.根据权利要求4所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119的应用，其特征在于：所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119用于促进种子萌发，青菜种子萌发率为97.68%。
6.一种权利要求1或2所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119的应用，其特征
在于：哈茨木霉（
Trichoderma harzianum ）HL119用于抑制植物病原菌生长。7.根据权利要求6所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119的应用，其特征在于：所述的病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum ）HL119的应用，其特征在于：所述的哈茨木霉HL119对芒果病菌的抑制率为94.31%，对芒果病防效高达77.39%。
权 利 要 求 书1/1页CN 110272833 A
哈茨木霉HL119及其应用
一、技术领域
[0001]本发明首次发现了一株哈茨木霉H L119，该菌株的拉丁文分类命名为：Trichoderma harzianum，该菌株已于2019年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号：CGMCC No.17980。
[0002]本发明涉及一株可用于农业生产的哈茨木霉菌及其用途，具体涉及的是一株哈茨木霉HL119及其应用。
二、背景技术
[0003]木霉菌(Trichoderma spp.)属半知菌亚门(Deuteromycotina)，丛梗孢目(Moniliales)，木霉属(Trichoderma)，是一种在土壤中分布极为广泛的真菌，也是一种对植物根际环境有益的重要生防菌，可促进植物生长发育，在植物抗病抗逆等方面起着重要作用。自1932年Weindling发现木素木霉菌可寄生在多种土传病原菌，人们开始意识到木霉菌对植物病原菌具有潜在的防治效果。
[0004]目前报道哈茨木霉菌是农业生产中重要的生防菌种，例如中国发明专利申请CN109337829A公开了哈茨木霉菌剂的制备，中国发明专利申请CN201811271848.2公开了哈茨木霉的促生长作用。因此，
寻新的哈茨木霉菌株对农业生产来讲具有重要的意义。
三、发明内容
[0005]本发明的一个目的是提供哈茨木霉HL119，这种哈茨木霉HL119用于促进农作物根部生长、抑制植物病原菌生长；本发明的另一个目的是提供这株哈茨木霉HL119的应用。[0006]本发明采用的技术方案是：这株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17980。
[0007]上述方案中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119的几丁质酶活性为0.8867U/ml。
[0008]上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于促进农作物种子萌发。[0009]上述方案中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于促进种子萌发，青菜萌发率97.68％。
[0010]上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于促进农作物根生长。[0011]上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于抑制植物病原菌生长。[0012]上述方案中病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌中的任意一种或多种。
[0013]上述方案中哈茨木霉HL119对番茄灰霉病菌的抑菌率高达93.85％。
[0014]所述的哈茨木霉HL119对芒果病防效77.39％
[0015]有益效果：
[0016]本发明所提供的哈茨木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进作为根部生长以及防治植物病原菌所导致的病害的效果。
[0017]保藏说明
[0018]菌种名称：哈茨木霉HL119；
[0019]拉丁名：Trichoderma harzianum；
[0020]保藏编号：CGMCC No.17980；
[0021]保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
[0022]地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；
[0023]保藏日期：2019年6月19日。
四、附图说明
[0024]图1为本发明哈茨木霉菌株β-1,3-葡聚糖酶活性测定所用葡萄糖标准曲线；[0025]图2为本发明哈茨木霉菌株几丁质酶活性测定所用N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。 五、具体实施方式：
[0026]下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。[0027]一株新的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17980。
[0028]哈茨木霉HL119菌落呈绒毛状，菌株呈同心圆环，菌丝呈金字塔形，分生孢子梗常呈现以主轴对称分布，顶端具有3或5个瓶梗，少数具有成对瓶梗(2或4个)。主轴两端间隔的侧生分支，每分支直接产生瓶梗或产生次级分支，最多产生三次级分支，次级分支少数成对，成对瓶梗横向不对称，瓶梗顶部缢缩，6.2-7.5μm×3.2-3.5μm中间稍有加粗，基部缢缩，产孢细胞1.7-2.2μm宽，瓶梗长度与产孢细胞宽比例为2.0-2.9，瓶梗最宽部与产包宽度比为1.1-1.2。分生孢子表面光滑，呈绿，2.5-3.0μm×2.7-3.5μm，长宽比为1.0-1.2。[0029]实施例1：哈茨木霉HL119的分离和保藏
[0030]1、哈茨木霉HL119，采集自黑龙江省伊春市的玉米地中。
[0031]土样采集：土壤的采集选用五点对角线取样法。即在采集地块的对角线选5等分点，然后用深度25
cm的的取土器在每一个点钻取约15-20cm的土样，再将5份土混合均匀，四分法取约50g的土样装入自封袋。在实验室内分装到50ml的塑料瓶中，4℃保存待用。[0032]木霉菌分离：采用稀释平板法，从冰箱中取10g土壤样品装入盛有90ml灭菌水和5-10粒直径4mm玻璃珠的三角瓶，然后在200r/min的摇床上摇30min。取5ml倒入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，混匀后，再吸取5ml转入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，充分混匀后吸取0.2ml 于直径9cm的平板上，用涂布器涂抹均匀，放于28℃恒温培养箱中培养。48-72h后挑取产绿分生孢子的菌落，转接到PDA平板上，28℃恒温培养箱中继续培养，待菌落直径长到4-5cm 时再次转接PDA平板28℃恒温培养。
[0033]2、哈茨木霉HL119菌种保藏
[0034]哈茨木霉菌株HL119于2019年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行真空冻干保藏，保藏编号为CGMCC No.17980，保藏期限为30年。[0035]3、通过形态学鉴定结合分子生物学(基因测序)鉴定结果为哈茨木霉。TEF序列见
序列表1。
[0036]实施例2：β-1,3-葡聚糖酶活性测定
[0037]DNS试剂的配制：称取酒石酸钾钠91g溶于500mL蒸馏水中，向溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸
3.15g和NaOH 20g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1000ml，贮于棕瓶中。
[0038]β-1，3-葡聚糖发酵产酶培养基配制：酵母粉3g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，K2HPO4 0.1g，FeSO4·7H2O 0.001g，KCl 0.05g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高压蒸汽灭菌。
[0039]葡萄糖标准曲线的制定：准确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄糖1000mg，溶于蒸馏水中，定容至1000ml，得到1mg/ml的葡萄糖标准溶液。取7支带刻度的试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml的葡萄糖溶液，后加入3ml DNS，最后定容至5ml，置于沸水中水浴5min，冷却后加蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm波长下测OD值。以葡萄糖实际含量(mg/ ml)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果如附图1所示。
[0040]将哈茨木霉HL119接种PDA平板培养，48h后用直径5mm打孔器打取菌落边缘三块菌饼于PD培养液中。将100ml PD培养液装入250ml三角瓶，置于28℃，180rpm摇床培养。72h后用真空抽滤器抽干菌丝，取1g菌丝接种于100ml产酶培养基，置于28℃，180rpm摇床培养，设置三个重复。于第三天测定β-1,3-葡聚糖酶酶活。取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg/ml的昆布多糖溶液lmL，50mM乙酸钠缓冲液(pH＝5)0.5ml，混匀。于40℃准确反应1h后，立即加入0.75mLDNS溶液以终止反应，混匀后沸水浴准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃
放置2min，再加入5ml蒸馏水混匀。反应液混匀后，取150μl反应混合液加入96孔加样板，在540nm测定吸光度，与标准曲线对比，计算酶活数值。
[0041]一个β-1,3-葡聚糖酶酶活单位定义：在特定条件下(40℃，pH＝5)，以1h催化分解昆布多糖产生lug葡萄糖酶量。
[0042]表1哈茨木霉HL119的β-1,3-葡聚糖酶活性
[0043]
[0044]可以看出，本发明棘孢木霉菌株HL119具有较好的β-1,3-葡聚糖酶活性。[0045]实施例3：几丁质酶活性测定
[0046]胶态几丁质的制备：取10g几丁质加入少许蒸馏水研磨，然后溶解于375ml浓盐酸中。4℃冰箱放置24h，使几丁质完全溶解，然后用纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1000ml，并不断搅拌。3000rpm离
心10min，弃上清液，沉淀用蒸馏水冲洗，溶解后再离心，反复操作10-15次直至溶液pH值呈中性为止，最后定容至1000ml。
[0047]几丁质产酶培养基：几丁质0.5g，MgSO4·7H2O 0.06g，FeSO4·7H2O 0.01g，NH4NO3 0.3g，KH2PO4 0.2g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高温灭菌。
[0048]N-乙酰葡萄糖标准曲线的制定：配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)1mg/ml的标准溶液，取7支容积＞25ml试管，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml试剂，后加入1.5ml DNS试剂，
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