(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011503541.8
(22)申请日 2020.12.18
(71)申请人 山东大学
地址 266237 山东省青岛市即墨滨海路72
号
(72)发明人 郭婷婷 孔健 吴佳鹏 辛永平
顾心怡
(74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限
公司 37221
代理人 李健康
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/74(2006.01)
C12P 5/00(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明公开了一株产生番茄红素的重组乳
酸乳球菌菌株及其构建方法和应用。所述的重组
途径：乳酸脱氢酶基因和α‑乙酰乳酸合成酶基
因的部分核苷酸序列；再使用质粒引入菠萝泛菌
来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因
(crtE)、八氢番茄红素合成酶基因(crtB)和八氢
番茄红素脱氢酶基因(crtI)构建得到。实验证实
本发明的重组乳酸乳球菌经过摇动培养后能够
产生番茄红素，也预示该重组乳酸乳球菌在保健
品和生物药物开发领域具有广阔的应用潜力。
权利要求书1页 说明书7页序列表6页 附图1页CN 112646764 A 2021.04.13
C N 112646764
A
1.一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，是通过在乳酸乳球菌中消除其番茄红素合成前体物的两条竞争途径：乳酸脱氢酶途径和α‑乙酰乳酸合成酶途径；再对该菌株中引入外源表达元件后构建获得；
其特征在于：
所述乳酸乳球菌选乳酸乳球菌NZ9000；所述消除乳酸脱氢酶途径和α‑乙酰乳酸合成酶途径是通过在乳酸乳球菌NZ9000基因组中敲除ldh、als基因的部分核苷酸序列实现，其中所述敲除的ldh基因核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，敲除的als基因核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述外源表达元件是菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI，该crtE、crtB和crtI的核苷酸序列以crtEBI表示，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；获得的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌基因型是NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI。
2.根据权利要求1所述的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述的crtE、crtB和crtI基因由质粒pSEC:crtEBI携带；该pSEC:crtEBI质粒包含来自于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因、PnisA启动子、氯霉素抗性标记、复制起始蛋白RepA和RepC，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
3.权利要求1所述产生番茄红素的重组乳酸乳球菌在发酵制备番茄红素中的应用。
4.权利要求1所述的应用，其特征在于，发酵制备番茄红素的方法及条件是：将重组菌株种子按照体积比2％的比例转接至发酵培养基中以如下条件发酵：30℃、100rpm～150rpm 摇动培养至OD600＝0.4，加入终浓度为10ng/mL的nisin，继续摇动培养12±2h，即产生含番茄红素的发酵产物；其中，所述的发酵培养基配方是：10g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L 胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/L β‑磷酸甘油二钠、0.005g/L氯霉素。
权 利 要 求 书1/1页CN 112646764 A
一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其构建方法和应用。
背景技术
[0002]几个世纪以来，乳酸乳球菌一直应用于奶酪、酸奶、酸菜等食品的发酵，是美国食品药品监督管理局认定的安全级微生物。乳酸乳球菌也有一些益生特性，如具有免疫调节特性、通过胃肠道(GIT)存活性，但又不在肠道内定植等，这些特性使乳酸乳球菌成为生物药物的优选传递体。2000年，Science杂志报道了使用重组乳酸乳球菌分泌白介素10以小鼠的结肠炎，随后20年内，以乳酸乳球
菌做载体用于近60种药物的传递，所针对的病症涵盖肠炎、流感、糖尿病、感染、乃至癌症。当下随着生物技术的迅猛发展，通过理性设计对乳酸乳球菌进行遗传改造，获得功能强化的菌株，实现对疾病的诊断或，符合精准医疗的发展趋势。
[0003]番茄红素是异戊二烯类化合物，属于类胡萝卜素，分子式是C
40H
56
，分子量为
536.89，由8个异戊二烯单元构成的包括11个共轭双键和2个非共轭双键的脂溶性碳氢化合物。由于番茄红素中存在多个共轭双键而具有极强的抗氧化能力，是自然界最强的抗氧化剂之一，具有抗辐射、防癌抗癌、防治心血管疾病等多种生理功能。因此番茄红素被广泛应用于药品、保健食品中。中国居民膳食营养素参考摄入量(2013版)建议番茄红素应为18‑70mg/天。
[0004]由于哺乳动物体内无法合成番茄红素，机体所需的番茄红素必须从外源摄取。目前番茄红素制备方式有植物提取、化学合成和微生物发酵。植物提取法获得的番茄红素无污染，但成本过高。化学合成法原料价格低廉、反应速率快、产量高，成本较低，但是终产物难以控制、与天然番茄红素结构差别大
、生物活性低，且有化学试剂残留，因此使用范围受到限制。发酵法生产是利用微生物转化葡萄糖等价格低廉的碳源产生番茄红素，再从菌体中提取出来。微生物发酵法具有生产周期短、不受气候、地理位置因素影响，且发酵过程易控制，产品安全性高等优点。很多光合细菌和部分革兰氏阴性非光合细菌均能合成番茄红素，例如固氮红细菌、噬夏孢欧文氏菌和草生欧文氏菌等，但是由于产物含量较低，只用作类胡萝卜素合成机理研究模型。近年代谢工程与合成生物学的发展快速推动了微生物细胞工厂的应用，以大肠杆菌、酵母菌和三孢布拉氏霉菌等作为细胞工厂实现了番茄红素高产量合成。
[0005]乳酸乳球菌是食品安全技术微生物，是生物药物传递的优选宿主，同时在乳酸乳球菌细胞合成番茄红素可以强化菌株的抗氧化能力，且重组乳酸菌具有抗癌防癌等生理功能，产物合成后无需提取可直接以活菌药物的形式服用，在产品的使用方式或活性保存方面优势巨大。经检索，通过遗传改造乳球乳球菌消除其番茄红素合成前体物的2条竞争途径：乳酸脱氢酶基因和α‑乙酰乳酸合成酶基因的部分核苷酸序列；再使用质粒引入菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE)、八氢番茄红素合成酶基因(crtB)和
八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)构建能够产生番茄红素的工程菌株重组乳酸乳球菌及其应用还未见报道。
发明内容
[0006]针对现有乳酸乳球菌无法合成番茄红素的不足，本发明提供了一种产生番茄红素的重组乳酸乳球
菌，同时提供了重组菌株的构建方法和应用。
[0007]本发明所述的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，是通过在乳酸乳球菌中消除其番茄红素合成前体物的两条竞争途径：乳酸脱氢酶途径和α‑乙酰乳酸合成酶途径；再对该菌株中引入外源表达元件后构建获得；
[0008]其特征在于：
[0009]所述乳酸乳球菌选乳酸乳球菌NZ9000；所述消除乳酸脱氢酶途径和α‑乙酰乳酸合成酶途径是通过在乳酸乳球菌NZ9000基因组中敲除ldh、als基因的部分核苷酸序列实现，其中所述敲除的ldh基因核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，敲除的als基因核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；该敲除的基因片段仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，例如敲除ldh基因的其他部分或全部、als基因的其他部分或全部，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。所述外源表达元件是菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI，该crtE、crtB和crtI 的核苷酸序列以crtEBI表示，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；获得的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌基因型是NZ9000ΔldhΔals/pSEC:crtEBI。
[0010]上述产生番茄红素的重组乳酸乳球菌中：所述的crtE、crtB和crtI基因由质粒pSEC:crtEBI携带；该
pSEC:crtEBI质粒包含来自于菠萝泛菌的crtE、crtB和crtI基因、PnisA启动子、氯霉素抗性标记、复制起始蛋白RepA和RepC，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0011]本发明所述产生番茄红素的重组乳酸乳球菌在发酵制备番茄红素中的应用。[0012]上述的应用中，发酵制备番茄红素的方法及条件是：将重组菌株种子按照体积比2％的比例转接至发酵培养基中以如下条件发酵：30℃、100rpm～150rpm摇动培养至OD600＝0.4，加入终浓度为10ng/mL的nisin(乳酸链球菌肽、尼生素)，继续摇动培养12±2h，即产生含番茄红素的发酵产物；其中，所述的发酵培养基配方是：10g/L葡萄糖、5g/L大豆蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、0.5g/L抗坏血酸钠、0.5g/L硫酸镁、19g/Lβ‑磷酸甘油二钠、0.005g/L氯霉素。
[0013]实验检测证实：上述使用100rpm摇动培养，番茄红素的产量是0.80±0.03mg/L。上述使用150rpm摇动培养，番茄红素的产量是0.86±0.04mg/L。
[0014]本发明提供了一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其在发酵制备番茄红素中的应用，在乳酸乳球菌细胞合成番茄红素可以强化菌株的抗氧化能力，且重组乳酸菌具有抗癌防癌等生理功能，产物合成后无需提取可直接以活菌药物的形式服用，在产品的使用方式或活性保存方面优势巨大，预示着该重组乳酸乳球菌以其具有的强抗氧化能力在保健品和生物药物开发领域应用前景广阔。
附图说明
[0015]图1：番茄红素标准品的液相谱检测图。
[0016]图2：重组乳酸乳球菌产生番茄红素的液相谱检测图。
具体实施方式
[0017]下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
[0018]下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中，乳酸乳球菌NZ9000购自Novagen公司；载体pSEC:crtEBI由青岛睿博兴科生物技术有限公司合成。载体pSEC:crtEBI构建所依据的骨架pSEC质粒的来源及构建方法参考文献：Loir YL, Nouaille S,Commissaire J,Brétigny L,Gruss A,Langella P.2001.Applied and Environmental Microbiology 67:4119‑4127。
[0019]实施例1：消除乳酸乳球菌中番茄红素合成前体物的竞争支路
[0020]利用CRISPR/Cas9结合单链DNA重组工程，对乳酸乳球菌NZ9000中番茄红素合成前体物的竞争
支路乳酸脱氢酶途径和α‑乙酰乳酸合成酶途径进行消除。以上竞争支路消除的方法是在乳酸乳球菌NZ9000的染体上敲除ldh基因的部分核苷酸序列和als基因的部分核苷酸序列。
[0021]上述利用CRISPR/Cas9结合单链DNA重组工程进行乳酸乳球菌染体片段敲除的相关方法已在论文Microb Cell Fact(2019)18:22中公开。
[0022](1)敲除ldh基因的部分核苷酸序列
[0023]敲除ldh基因的部分核苷酸序列的具体方法：
[0024]①构建打靶质粒；②同源重组及CRISPR/Cas9打靶筛选；③敲除突变株的验证；④同源重组质粒消除。
[0025]上述构建打靶质粒方法是：
[0026]将引物ldh‑spacerF(5’‑AAACCATACGCTTTTGCCCTTGTTAACCAG‑3’)和ldh‑spacerR (5’‑AAAACTGGTTAACAAGGGCAAAAGCGTATG‑3’)进行体外磷酸化和退火，产物插入到BsaI限制性内切酶处理的pTHCas9质粒中，获得打靶质粒pTHCas9ldh。
[0027]体外退火反应体系为：5μL 10μM ldh‑spacerF、5μL 10μM ldh‑spacerR、2.5μL 10
O。反应条件为：37℃×T4 DNA ligase buffer(NEB)、0.5μL T4多聚核苷酸激酶、12μL ddH
2
30min，95℃5min，自然降温至25℃。
[0028]上述同源重组及CRISPR/Cas9打靶筛选方法是：
[0029]在GM17培养基(含5μg/mL氯霉素)中过夜活化重组乳酸乳球菌NZ9000/pL‑RecT，以2％比例转接于SolI(含5μg/mL氯霉素)中在30℃静置培养至OD600＝0.2，加入终浓度为10ng/μL的nisin后继续培养至OD600＝0.4。在4℃6000rpm离心10min收集菌体细胞，使用SolII洗涤菌体细胞两次后，将菌体细胞重悬于原培养体积1/50的SolII中，制得感受态细胞。向感受态细胞中加入100ng的打靶质粒pTHCas9ldh和100μg的单链DNA ldho(5’‑TCCCC TTGAGTTTTTTCTTTAAAAAGGTCAACAATACCTAGATTTTCTTTAATTCCTTTCAAATTATAAACGAGTATTTT‑
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