(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810707153.8
(22)申请日 2018.07.02
司
地址 710077 陕西省西安市高新区锦业路
69号创业研发园C区20号
(72)发明人 范代娣 宇文伟刚 马晓轩 马沛
米钰
(74)专利代理机构 西安新思维专利商标事务所
有限公司 61114
代理人 李罡
(51)Int.Cl.
C12N 15/62(2006.01)
C07K 14/78(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 15/81(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及重组人源型胶原蛋白的羟基化
方法，通过将来源于孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶
化；孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶，其基因序列为
SEQ ID No.1，对应的氨基酸序列为SEQ ID
No.2。本发明提供了一种易于实现、制备工艺简
单的重组胶原羟基化方法。该方法制备的重组胶
原与天然胶原在氨基酸组成及空间结构上更相
近，活性更相似，与常规方法制备的重组胶原相
比其应用领域可以拓展，这对于日益发展的医疗
器械、化妆品及食品领域来说，有更多的优秀材
料可以选择，
非常有益。
权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图4页CN 109022464 A 2018.12.18
C N 109022464
A
1.重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，其特征在于：
通过将来源于孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶与人源胶原基因共表达，从而实现胶原的羟基化；
孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶，其基因序列为 SEQ ID No.1，对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，其特征在于：
所述的人源胶原基因选自I型、II型、III型或IV型人胶原蛋白类型α链蛋白的全序列、部分序列及其修饰序列，或不同型来源序列的拼接序列、重复序列。
3.根据权利要求1所述的重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，其特征在于：
所述的共表达是通过基因克隆的手段使两种基因在同一个宿主中实现共表达，包括外源质粒表达、基因组重组表达及两者的组合。
4.根据权利要求3所述的重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，其特征在于：
所述的表达宿主选自大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌中的一种。
5.羟基化重组人源型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）构建人源型胶原蛋白基因与来源于孢囊菌RH1、基因序列为 SEQ ID No.1、对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2 的脯氨酸羟化酶基因共表达菌株；
（2）表达胶原蛋白与脯氨酸羟化酶；
（3）分离纯化胶原蛋白，即得羟基化重组胶原蛋白。
6.根据权利要求5所述的羟基化重组人源型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（1）具体为：
（1.1）通过PCR或全基因合成的手段分别获得胶原蛋白基因及来源于孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶基因；
（1.2）选择合适的表达系统，构建相应的质粒；
（1.3）将质粒转入表达宿主中；
（1.4）筛选阳性转化子，即得共表达菌株。
7.根据权利要求6所述的羟基化重组人源型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：
在步骤（1.1）中，所述的人源胶原基因选自I型、II型、III型或IV型人胶原蛋白类型α链蛋白的全序列、部分序列及其修饰序列，或不同型来源序列的拼接序列、重复序列；
在步骤（1.2）中，合适的表达系统选自大肠杆菌表达系统、酵母表达系统或枯草杆菌表达系统中的一种；
在步骤（1.2）中，相应的质粒是指能够在选定的表达系统中高通量组成表达或诱导表达胶原基因及脯氨酸羟化酶基因的质粒。
8.根据权利要求5所述的羟基化重组人源型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中的表达为组成表达、诱导表达中的一种或者两种表达的组合，其中诱导表达的诱导剂为IPTG、β-半乳糖苷、甲醇或乙醇。
9.根据权利要求5所述的羟基化重组人源型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中，胶原蛋白的分离纯化方法采用盐析、谱层析、亲和层析、酸碱沉淀、膜分离中的一种或几种的组合。
10.如权利要求5所述的制备方法制得的羟基化重组人源型胶原蛋白。
重组人源型胶原蛋白的羟基化方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化工领域，具体涉及一种重组人源型胶原蛋白的羟基化方法。
背景技术
[0002]胶原蛋白是一种生物高分子蛋白，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的 ２５％～３０％。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以
及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系，是生物科技产业最关键的原材料之一，在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用。
[0003]目前工业化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物结缔组织，但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险同时大规模的制备对供给侧的动物饲养造成巨大的压力。
[0004]随着基因工程技术的大规模应用，基因工程重组表达胶原利用模式化表达宿主以外源蛋白表达的形式成功的解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。与传统的动物胶原提取相比，基因工程重组制备胶原具备：1.生产的胶原种类繁多，可以是常见的牛、猪、鱼等来源的胶原蛋白，同样可以生产人源的胶原蛋白，在医疗器械等领域上具有更好的安全性及免疫优效性。2.可以有效的避免动物源疾病，重组胶原通常以简单的原核或者真核细胞为表达宿主，其细胞致病源由于与人的细胞结构差别巨大，不能相互传播。3.生产周期短，节约成本，可以快速放大，适于工业化大规模生产。与动物培养长动辄3-5个月相比，微生物培养周期仅需2、3天且培养简单，提供简单的C源、N源就能进行大规模培养，易于经行工业级的制备。因此重组胶原特别是重组人源胶原的制备是目前胶原生产研究的热点。
[0005]目前对于重组胶原的制备的报道有很多，主要集中在人源胶原基因的表达，如中国专利CN102146426B公开了一种利用毕赤酵母表达人源部分基因的拼接序列重组胶原蛋白的生产方法；中国
专利 CN101200718B 公开了类人胶原蛋白基因、其不同重复数的同向串联基因、含有串联基因的重组质粒及制备方法；中国专利CN103725623 A 公开了一种分泌表达人Ⅲ型胶原α链蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用 。羟脯氨酸是胶原蛋白所独有的非天然氨基酸，其表达对胶原蛋白的螺旋域形成及结构的稳定具有重要作用，是重组胶原与天然胶原与天然胶原结构的主要区别之一，以上重组制备的胶原均无法克服胶原羟基化的问题。
[0006]Buechter DD，Paolella DN, Leslie BS等（2003，The Journal of Biological Chemistry）报道了在含有高浓度 NaCl 的培养基中添加羟脯氨酸培养以大肠杆菌为表达宿主的重组胶原表达菌获得羟基化的重组胶原蛋白。唐云平（2015，Applied Biochemistry and Biotechnology）报道了将类人胶原蛋白、人源脯氨酸羟化酶和 D－阿拉伯糖－1，4－内酯酶基因一起在大肠杆菌中共表达，获得了羟化的类人胶原蛋白。以上方法虽然都能实现胶原的羟基化，但是前者需要高渗的培养环境，不易于重组菌的生产及胶原的高表达，后者需要共表达人源脯氨酸羟化酶，其有4个亚基结构复杂外源表达条件苛刻表达活性低，均
不能大规模应用。因此，迫切需要一种简单易于实现重组胶原羟基化的制备方法，解决目前重组胶原羟基化难题，为羟基化重组胶原提供好的技术手段和生产方法，以拓展重组胶原的应用领域。
发明内容
[0007]本发明的目的是提供一种重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，避免了苛刻的培养条件，在不影响胶原高表达的基础上通过高表达的脯氨酸羟化酶实现胶原羟化。
[0008]本发明所采用的技术方案为：
重组人源型胶原蛋白的羟基化方法，其特征在于：
通过将来源于孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶与人源胶原基因共表达，从而实现胶原的羟基化；
孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶，其基因序列为 SEQ ID No.1，对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
[0009]所述的人源胶原基因选自I型、II型、III型或IV型人胶原蛋白类型α链蛋白的全序列、部分序列及其修饰序列，或不同型来源序列的拼接序列、重复序列。
[0010]所述的共表达是通过基因克隆的手段使两种基因在同一个宿主中实现共表达，包括外源质粒表达、基因组重组表达及两者的组合。
[0011]所述的表达宿主选自大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌中的一种。
[0012]羟基化重组人源型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）构建人源型胶原蛋白基因与来源于孢囊菌RH1、基因序列为 SEQ ID No.1、对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2 的脯氨酸羟化酶基因共表达菌株；
（2）表达胶原蛋白与脯氨酸羟化酶；
（3）分离纯化胶原蛋白，即得羟基化重组胶原蛋白。
[0013]步骤（1）具体为：
（1.1）通过PCR或全基因合成的手段分别获得胶原蛋白基因及来源于孢囊菌RH1的脯氨酸羟化酶基因；
（1.2）选择合适的表达系统，构建相应的质粒；
（1.3）将质粒转入表达宿主中；
（1.4）筛选阳性转化子，即得共表达菌株。
[0014]在步骤（1.1）中，所述的人源胶原基因选自I型、II型、III型或IV型人胶原蛋白类型α链蛋白的全序
列、部分序列及其修饰序列，或不同型来源序列的拼接序列、重复序列；
在步骤（1.2）中，合适的表达系统选自大肠杆菌表达系统、酵母表达系统或枯草杆菌表达系统中的一种；
在步骤（1.2）中，相应的质粒是指能够在选定的表达系统中高通量组成表达或诱导表达胶原基因及脯氨酸羟化酶基因的质粒。
[0015]步骤（2）中的表达为组成表达、诱导表达中的一种或者两种表达的组合，其中诱导表达的诱导剂为IPTG、β-半乳糖苷、甲醇或乙醇。
[0016]步骤（3）中，胶原蛋白的分离纯化方法采用盐析、谱层析、亲和层析、酸碱沉淀、
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