(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510345031.5
(22)申请日 2015.06.19
C07K 14/47(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)
(71)申请人广西南宁灵康赛诺科生物科技有限
公司
地址530003 广西壮族自治区南宁市高新东
三路3号
(72)发明人岳峰 陆春玲
(74)专利代理机构广西南宁汇博专利代理有限
公司 45114
代理人
梁山丹
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种Aβ1-42寡聚体，所述的
Aβ1-42寡聚体主要为寡聚体和单体的混合物；
为12-20KD，为三聚体和四聚体；所述单体经蛋白
免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4.5KD。还公
开了所述Aβ1-42寡聚体的制备方法和鉴定方
法。本发明提供的Aβ1-42寡聚体成分较单一、产
物稳定，为建立理想和可靠的AD 模型提供良好的
基础；其制备方法简单、收率高、省时；所采用的
SDS-PAGE 结合蛋白免疫印记鉴定方法，具有敏度
高、特异性强、方便快速、操作简单、费用较低等优
点。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图1页
(10)申请公布号CN 104974243 A (43)申请公布日2015.10.14
C N 104974243
A
1.一种Aβ1-42寡聚体，其特征在于：所述的Aβ1-42寡聚体主要为寡聚体和单体的混合物；
所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为12-20KD，为三聚体和四聚体；
所述单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4.5KD。
2.根据权利要求1所述Aβ1-42寡聚体，其特征在于，所述的Aβ1-42寡聚体的制备方法为：取Aβ1-42合成肽，在室温下完全溶解在HFIP中，所得溶液转移到离心管中，用干浴氮吹仪使HFIP彻底吹干；加入DMSO使离心管底部的固体完全溶解，加入HEPES缓冲液，混合均匀，即得。
3.一种如权利要求1或2所述Aβ1-42寡聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL HFIP中，在室温下静置30-60分钟，得到完全溶解的溶液；
（2）将步骤（1）得到的溶液转移到硅化的离心管，在干浴氮吹仪上吹8-15分钟，使HFIP 彻底吹干，得到透明片状固体沉于管底；
（3）在所述离心管中加入40µl DMSO，使离心管底部的固体完全溶解，再加入pH值为7.4的浓度为l0mM HEPES缓冲溶液，使溶液最后终体积为1ml，混合均匀，即得。
4.一种如权利要求1或2所述Aβ1-42寡聚体的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳：取Aβ1-42寡聚体溶液2μL，与18μL 4X电泳上样缓冲液混合均匀，然后上样，电泳上样量为5ul/泳道，电泳用的胶为4–12%的梯度胶，同时在一个泳道加入10μL分子量为3.6-260KD的预染分子量标准品，电泳时选择80V电压电泳30-40分钟，然后转100v电压继续电泳2小时；
（2）转膜：将电泳好的蛋白条带转移到PVDF膜上，半干法转膜，时间为6分钟，将转好的PVDF膜按加样泳道的大小裁剪，然后将剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分钟；
（3）封闭：再将PVDF膜浸泡在含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上振荡，摇床上慢速振荡，室温条件下封闭1小时；
(4)洗膜：将步骤（3）得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗2-3次，每次5分钟；
(5)一抗孵育：将步骤（4）得到的PVDF膜浸泡在含有6E10的一抗溶液中，室温下孵育1小时；
(6)洗一抗膜：将经过一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6次，每次5分钟；
(7)二抗孵育：将漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，室温下孵育1小时；
(8)洗二抗膜：将经过二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6次，每次5分钟；
(9)化学发光曝光：将HRP底物液均匀加在经步骤（8）漂洗过的PVDF膜上，在5-30秒内分别进行暗室曝光显影，从中选择条带清晰的胶片作为最后结果。
一种Aβ1-42寡聚体及其制备、鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及β-淀粉样蛋白领域，具体涉及一种Aβ1-42寡聚体及其制备、鉴定方法。
背景技术
[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)也称为老年痴呆症，是发生在老年期或老年前期的一种慢性、持续性、退化性的脑变性疾病，其临床表现为记忆减退、认知障碍、人格改变等。该病的病理特
征主要包括大脑皮质和海马区域的细胞外出现以β-淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)为核心的老年斑、细胞内神经原纤维缠结等病变。在美国AD是仅次于心血管病、癌症和脑卒中的第四大死亡杀手，据统计目前全世界AD发病人数高达2500万，我国AD患者已达到600余万，居世界首位，AD病程时间长且目前尚无彻底根治的药物，它严重威胁着人类的健康，给患者及家属带来巨大的影响。因此建立理想及可靠的AD动物模型，对于研究和探讨AD的病因、病理过程以及寻和筛选有效药物显得尤为重要。[0003] Aβ是由淀粉样前体蛋白经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽，Aβ的大量沉积，是导致AD病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。Aβ在脑内有多种存在形式，如：低分子量Aβ单体、Aβ寡聚体、不溶性Aβ纤维体等。Aβ单体是可溶性的低分子物质，但是当胞内环境，如pH、温度、离子浓度、蛋白浓度等改变时会诱发Aβ单体快速聚集，形成二聚体、三聚体或可溶性的Aβ寡聚体，Aβ寡聚体的稳定性较差，易向Aβ纤维体转化。Aβ的种类分为Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42和Aβ1-43，其中Aβ1-42的毒性最大，是AD的主要致病因素，因此，研究Aβ1-42是当前的热点。
[0004] 近年来，有科学家提出，Aβ纤维体与记忆损害及神经细胞缺乏的关系不大，推测可溶性Aβ单体和Aβ寡聚体是AD的主要致病因素。国内外制备、合成Aβ1-42的寡聚体均不稳定，淀粉样肽在体外容易随机形成各种高分子量或低分子量的混合产物，这种组分不均一的混合物直接影响到实验结果的准确性和可靠性。近年来，许多研究者用多种方法制备Aβ1-42寡聚体，但收率都较低、产物不稳定、成分复杂。Aβ1-42寡聚体的产物不稳定，成分复杂，就无法保障其诱导模型的成功建立，从而直接影响到实验
结果的准确性和可靠性。因此，制备成分较单一、稳定的Aβ1-42寡聚体，可为AD动物模型的成功建立打下良好的基础，也为AD的发病机制、病理过程、寻和筛选有效药物提供有效依据。
发明内容
[0005] 针对现有制备、合成Aβ1-42的寡聚体不稳定、成分复杂、收率低等不足，本发明提供一种新合成的Aβ1-42寡聚体。本发明提供的Aβ1-42寡聚体成分较单一、产物稳定，为建立理想和可靠的AD模型提供良好的基础；其制备方法简单、收率高、省时；所采用的SDS-PAGE结合蛋白免疫印记鉴定方法，具有敏度高、特异性强、方便快速、操作简单、费用较低等优点。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 一种Aβ1-42寡聚体，所述的Aβ1-42寡聚体主要为寡聚体和单体的混合物；所述寡聚体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为12-20KD，为三聚体和四聚体；所述单体经蛋白免疫印记法电泳鉴定：分子量为4-4.5KD。
[0008] 以上所述Aβ1-42寡聚体，所述的Aβ1-42寡聚体的制备方法为：取Aβ1-42合成肽，在室温下完全溶解在HFIP中，所得溶液转移到离心管中，用干浴氮吹仪使HFIP彻底吹干；加入DMSO使离心管底部的固体完全溶解，加入HEPES缓冲液，混合均匀，即得。[0009] 以上所述Aβ1-42寡聚体的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 1.将1mg的Aβ1-42合成肽，加入220-225μL HFIP中，在室温下静置30-60分钟，得到完全溶解的溶液；
[0011] 2.将步骤1得到的溶液转移到硅化的离心管，在干浴氮吹仪上吹8-15分钟，使HFIP彻底吹干，得到透明片状固体沉于管底；
[0012] 3.在所述离心管中加入40μl DMSO，使离心管底部的固体完全溶解，再加入pH值为7.4的浓度为l0mM HEPES缓冲溶液，使溶液最后终体积为1ml，混合均匀，即得。[0013] 以上所述Aβ1-42寡聚体的鉴定方法，包括以下步骤：
[0014] 1.SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳：取Aβ1-42寡聚体溶液2μL，与18μL 4X电泳上样缓冲液混合均匀，然后上样，电泳上样量为5ul/泳道，电泳用的胶为4–12％的梯度胶，同时在一个泳道加入10μL分子量为3.6-260KD的预染分子量标准品，电泳时选择80V电压电泳30-40分钟，然后转100v电压继续电泳2小时；
[0015] 2.转膜：将电泳好的蛋白条带转移到PVDF膜上，半干法转膜，时间为6分钟，将转好的PVDF膜按加样泳道的大小裁剪，然后将剪裁好PVDF膜浸泡到TBST溶液中5-10分钟；
[0016] 3.封闭：再将PVDF膜浸泡在含有5％脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床上振荡，摇床上慢速振荡，转速可为65-75转/分钟，室温条件下封闭1小时；
[0017] 4.洗膜：将步骤3得到的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗2-3次，每次5分钟；
[0018] 5.一抗孵育：将步骤4得到的PVDF膜浸泡在含有6E10的一抗溶液中，室温下孵育1小时；
[0019] 6.洗一抗膜：将经过一抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6次，每次5分钟；
[0020] 7.二抗孵育：将漂洗好的PVDF膜浸泡在含有辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，室温下孵育1小时；
[0021] 8.洗二抗膜：将经过二抗孵育的PVDF膜浸泡在TBST溶液中，在摇床上震荡漂洗6次，每次5分钟；
[0022] 9.化学发光曝光：将HRP底物液均匀加在经步骤8漂洗过的PVDF膜上，在5-30秒内分别进行暗室曝光显影，从中选择条带清晰的胶片作为最后结果。
[0023] 与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
[0024] 1.本发明提供的Aβ1-42寡聚体成分较单一，主要含有12-20KD寡聚体，纯度80％以上，另含有少量4-4.5KD单体；Aβ1-42寡聚体很稳定，在4℃至室温条件下，其分子
量在72小时内基本不变。本发明为建立理想和可靠的AD模型提供良好的基础，能保证实验结果的准确性和可靠性，为探讨AD的发病机制、病理过程以及寻和筛选有效药物提供了有效依据。
[0025] 2.本发明Aβ1-42寡聚体的制备方法简单、收率高、省时、成本低；选用HEPES缓冲溶液，能较长时间控制恒定的pH范围，与F12缓冲液相比取得更好的缓冲效果。[0026] 3.采用SDS-PAGE结合蛋白免疫印记法鉴定本发明Aβ1-42寡聚体，该方法不仅能检测Aβ42单体或寡聚体分子量的大小，同时还可以检验Aβ42单体或寡聚体的纯度，与酶联免疫吸附法、流式荧光技术、透射电子显微镜观察相比，具有敏度高、特异性强、方便快速、操作简单、费用较低、图像清晰、结果准确等优点，克服了当前蛋白免疫印记法存在的蛋白质变性、背景过高、电泳过程中出现“拖尾”现象、阳性条带很弱等问题。
[0027] 4.本发明整个检测过程均在室温下进行，减少加热、冷却等步骤，简化了整个操作过程；一抗与二抗都是来源于鼠其匹配性极好、浓度适宜、不会与封闭剂有交叉反应、二抗不会发生非特异性结合、一抗中含有6E10，检测过程中不会出现背景高、阳性条带很弱等现象。
附图说明
[0028] 图1为实施例1、2得到的Aβ1-42寡聚体的蛋白免疫印迹图。
[0029] 图2为实施例1得到的Aβ1-42寡聚体合成后随时间变化规律图。
[0030] 图3为实施例1得到的Aβ1-42寡聚体造模手术前后稳定性试验图。
具体实施方式
[0031] 以下将结合具体实施例对本发明进一步说明，但不限制本发明的保护范围和应用范围。
[0032] 一、仪器和试剂
[0033] 1.主要仪器。
[0034] (1)干浴氮吹仪 天津市恒奥科技发展有限公司提供
[0035] (2)振荡仪 德国eppendorf公司提供
[0036] (3)电泳槽 美国invitrogen公司提供
[0037] (4)转膜仪 美国invitrogen公司提供
[0038] (5)PVDF膜 美国Life technologies公司提供，货号：IB401001 [0039] 2.主要试剂。
[0040] (1)Aβ1-42合成肽，英文名：β-Amyloid(1-42)，分子式C203H311N55O60S1，分子量4514.1，C
hinese Peptide公司提供，货号：AMYD-003，纯度96.9％以上，序列如下：Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Va l-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val -Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。
[0041] (2)HFIP，中文名：1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，德国sigma公司提供，货号：105228。
[0042] (3)DMSO，中文名：二甲基亚砜，德国sigma公司提供，货号：D8418。
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