(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010394768.7
(22)申请日 2020.05.12
(71)申请人 上海荣瑞医药科技有限公司
地址 201321 上海市浦东新区芙蓉花路500
弄2号楼1-2层
(72)发明人 周国庆 张苏宏 张凡
(74)专利代理机构 成都坤伦厚朴专利代理事务
所(普通合伙) 51247
代理人 吴亦雨
(51)Int.Cl.
C12N 7/01(2006.01)
C12N 7/04(2006.01)
A61K 39/00(2006.01)
A61K 48/00(2006.01)
A61K 35/76(2015.01)
A61K 47/46(2006.01)A61K 47/69(2017.01)A61P 35/00(2006.01)A61K 35/17(2015.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种溶
瘤病毒疫苗及其与免疫细胞联合肿瘤的药
物。本发明通过对VSV野生型病毒基质蛋白M进行
定点突变，提供了一种全新的溶瘤病毒减毒株，
其基质蛋白M基因序列如SEQ ID NO 3所示。该减
毒株可单独作为药物肿瘤，安全性与治愈率
均优于野生型病毒及其它已知减毒株。本发明在
所述溶瘤病毒减毒株的基础上，通过在减毒株内
插入NY -ESO -1，还提供了一种可应用在肿瘤
中的疫苗。所述疫苗治愈率高、生物安全性高。本
发明在所述疫苗的基础上，还将疫苗与TCR -T细
胞联合应用，提供了一种可高效多类肿瘤的
药物；在小鼠的肺癌模型上，治愈率可达到惊人
的95%。权利要求书1页 说明书10页序列表3页 附图13页CN 111286493 A 2020.06.16
C N 111286493
A
1.一种溶瘤病毒减毒株，其特征在于：对所述溶瘤病毒的基质蛋白M进行改造，改造后的基质蛋白M的基因序列如SEQ ID NO 3所示。
2.一种溶瘤病毒减毒株，其特征在于：所述减毒株以VSV MuddSummer亚型株为基础，至少对VSV MuddSummer亚型株的M蛋白基因进行如下定点基因突变后获得：第51位甲硫氨酸突变为精氨酸；第111位亮氨酸编码碱基敲除；第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸；第226位丝氨酸突变为精氨酸。
3.权利要求1或2所述的溶瘤病毒减毒株作为载体在医药领域中的应用。
4.根据权利要求3所述的溶瘤病毒减毒株作为载体在医药领域中的应用，其特征在于：所述溶瘤病毒减毒株在制备药物或疫苗中的应用。
5.一种溶瘤病毒疫苗，其特征在于：在权利要求1或2所述减毒株中插入抗原后制备得到。
6.根据权利要求5所述的溶瘤病毒疫苗，其特征在于：所述抗原为特异性肿瘤抗原。
7.根据权利要求6所述的溶瘤病毒疫苗，其特征在于：所述抗原为NY -ESO -1、gp33、gp100、TX103、Mucin -1、WT -1、MART -1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART -1、col6A3、tyrosinase、T antigen、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴素互变异构酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪氨酸酶、SSX2、细胞周期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽释放酶4、IGF2B3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3中的任意一种。
8.权利要求5～7任意一项所述溶瘤病毒疫苗制备的抗肿瘤药物或癌症的药物。
9.根据权利要求8所述的溶瘤病毒疫苗的抗肿瘤药物或癌症的药物，其特征在于：所述药物同时包括所述溶瘤病毒疫苗和免疫细胞。
10.根据权利要求9所述的溶瘤病毒疫苗制备的抗肿瘤药物或癌症的药物，其特征在于：所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞中的任意一种；
所述免疫细胞为T细胞时，所述T细胞为TCR -T细胞、CAR -T细胞、γ/δ-T细胞中的任意一种；所述T细胞为TCR -T细胞时，所述TCR -T细胞为经慢病毒或mRNA技术转染的TCR -T细胞，或从血液中分离出的TCR -T细胞；所述免疫细胞为NK细胞时，所述NK细胞为CAR -NK中的任意一种；所述免疫细胞为巨噬细胞时，所述巨噬细胞为CAR -M细胞中的任意一种。
11.根据权利要求9或10所述的溶瘤病毒疫苗制备的抗肿瘤药物或癌症的药物，其特征在于：所述肿瘤或癌症为头颈部癌、黑素瘤、软组织肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、圆细胞型脂肪肉瘤中的任意一种。
权 利 要 求 书1/1页CN 111286493 A
一种溶瘤病毒疫苗及其与免疫细胞联合肿瘤的药物
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种溶瘤病毒疫苗及其与免疫细胞联合肿瘤的药物。
背景技术
[0002]根据国家癌症中心2019年1月发布的全国癌症统计数据显示：2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症。肝癌、结直肠癌、女性乳腺癌等实体瘤依然是我国主要的恶性肿瘤。恶性肿瘤（癌症）已经成为严重威胁中国人健康的主要公共卫生问题之一。尽管目前癌症在手术、化疗、放疗及分子靶向等多学科综合方面取得很大进展，但肿瘤的复发和转移迄今仍缺乏有效手段。因此，新型手段，即肿瘤免疫逐渐受到人们的关注。[0003]2003年，Giedlin MA提出水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）可以作为肿瘤的溶瘤病毒。其原理是它不能与正常细胞中内源性的IFN-β相互作用，只能选择性地在肿瘤细胞中扩增、生长。2009年，加拿大麦克马斯特大学研究表明：VSV可以作为新的肿瘤疫苗载体促进免疫应答。近年来，VSV的相关研究已越来越受到研究者们的重视。从安全的角度而言，VSV对人类相对安全，目前未见VSV感染人类的案例。
[0004]VSV是一种原型非节段负链RNA病毒，其大小11kb基因组编码5种蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶蛋白(L)。VSV可表达包括低密度脂蛋白受体、磷脂酰丝氨酸
、唾液糖脂和硫酸类肝素在内的多种细胞表面分子，并可通过此类分子附着细胞表面。具有复制及跨突触速度快，外源基因表达量超高的特点。与目前正在研发的其他溶瘤细胞病毒平台相比，VSV基因组小，容易操作；复制时间更短；有独立的细胞周期；在广泛的细胞系中可快速增长，且具有较高滴度，允许大规模生产；宿主细胞的细胞质复制无转化风险。这种溶瘤病毒不会集成到DNA中，并且经过减毒后可以避免野生型病毒引起的神经系统炎症。因此，VSV在肿瘤免疫上具有很大的潜力。
[0005]在肿瘤模式动物中，研究发现VSV能显著消除脑部肿瘤，对乳腺癌和骨肉瘤也有明显的抑制作用。研究者通过对VSV对肝癌的抗肿瘤功能及毒副作用的研究发现肝癌荷瘤小鼠的生存期显著增加，且并未产生明显的毒副作用。经VSV-GP处理后前列腺癌小鼠的皮下肿瘤及骨转移瘤明显减小；减小黑素瘤荷瘤小鼠的原位肿瘤及肺转移瘤也得到显著改善。M51R VSV可直接诱导结直肠癌细胞的凋亡。同时，VSV也可通过调控固有免疫或者获得性免疫进一步影响肿瘤的发展。M51R VSV降低结直肠癌组织中的免疫抑制细胞MDSC、巨噬细胞的浸润，增加CD4+T细胞的浸润，从而减少恶性腹水的形成。VSV能够诱导CD8特异性T细胞的免疫应答，降低其它免疫抑制细胞的作用，从而增强肿瘤疫苗的疗效。以上研究可见VSV具有较强的抗肿瘤作用，并具有很好的安全性。
[0006]目前的研究表明，单独使用VSV进行肿瘤免疫时，反应率存在一定的瓶颈，这主要与其特异性不足及肿瘤内微环境的抑制作用有关。因此，关于VSV与其他的联合应用也越来越多。在乳头瘤小鼠模型的研究中发现，VSV联合肿瘤疫苗明显提高了抗肿
瘤效应。来自明尼苏达大学医学院的Manish R. Patel等人发表了使用JAK/STAT抑制剂（Ruxolitinib）联合VSV-IFNβ对肺癌进行，结果显示，Ruxolitinib联合VSV-IFNβ取得了较好的溶瘤效果。多种细胞因子武装的溶瘤病毒也被用于与CAR-T细胞疗法联合；在异种移植瘤模型中，这种联合策略增强了抗肿瘤活性。
[0007]T细胞受体基因工程改造的T细胞（T cell receptor gene engineered T cells, TCR-T）疗法是以修饰T细胞为基础的，应用于恶性肿瘤的过继细胞免疫，TCR介导T细胞识别MHC分子递呈的抗原，从而使得抗原特异性的T细胞对肿瘤靶细胞发挥免疫效应。现有研究使得联合使用VSV和TCR-T肿瘤成为可能。VSV可通过在肿瘤细胞内的选择性复制从而溶解肿瘤细胞，而溶解的肿瘤细胞会诱导肿瘤特异性免疫应答，促进T细胞的活化、扩增、募集，活化的T细胞又可在肿瘤内通过调控免疫抑制等方式杀伤肿瘤细胞。两者联合使用，理论上可以发挥优于单独使用VSV疗法或TCR-T疗法的效果。
[0008]但在联合使用VSV和TCR-T进行肿瘤免疫时，仍然至少存在如下问题：（1）直接将VSV野生株或减毒株与TCR-T联合使用，治愈率不高，与单独使用一种疗法相比，效果提升不明显；（2）野生型VSV仍然存在一定的安全风险，目前已知对啮齿类动物具有较强的神经毒性，为临床使用考虑，需要对其进行基因修饰，以进一步降低致病风险；（3）随机进行基因修饰，可能导致溶瘤效果不佳，也可能无法成功包装，根本无法制备出重组病毒。
[0009]因此，提供一种安全性良好、治愈率高的VSV重组病毒，并将其与TCR-T及其他免疫细胞作为药物联合使用，对肿瘤基因领域具有重要的科研价值和应用意义。
发明内容
[0010]本发明的目的是提供一种溶瘤病毒疫苗及其与免疫细胞联合肿瘤的药物。[0011]为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株溶瘤病毒减毒株，其基质蛋白（M）的基因序列如SEQ ID NO 3所示。
[0012]相应的，一株溶瘤病毒减毒株，所述减毒株以VSV MuddSummer亚型株为基础，至少进行如下定点基因突变后获得：第51位甲硫氨酸（M）突变为精氨酸（R）；第111位亮氨酸（L）编码碱基敲除；第221位缬氨酸（V）突变为苯丙氨酸（F）；第226位丝氨酸（S）突变为精氨酸（R）。
[0013]相应的，所述的溶瘤病毒减毒株作为载体在医药领域中的应用。
[0014]优选的，所述溶瘤病毒减毒株在制备药物或疫苗中的应用。
[0015]相应的，一种溶瘤病毒疫苗，在所述减毒株中插入抗原后制备得到。
[0016]相应的，一种溶瘤病毒疫苗，在所述减毒株中插入肿瘤抗原后制备得到。[0017]优选的，所述抗
原为NY-ESO-1、gp33、gp100、TX103、Mucin-1、WT-1、MART-1、MAGE A1、MAGE A3、MAGE A4、MAGE B2、PRAME、SURVIVIN、MART-1、col6A3、tyrosinase、T antigen、SLC45A2、VCX/Y、HPV、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA 125、Her2、多巴素互变异构酶、BAGE蛋白、GAGE蛋白、存活蛋白、酪氨酸酶、SSX2、细胞周期蛋白-A1、KIF20A、MUC5AC、Meloe、Lengsin、激肽释放酶4、IGF2B3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3及其他肿瘤抗原中的任意一种。
[0018]相应的，所述溶瘤病毒疫苗在制备肿瘤免疫药物中的应用。
[0019]优选的，所述药物同时包括所述溶瘤病毒疫苗和免疫细胞，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞(macrophage)或其他免疫细胞。
[0020]优选的，所述免疫细胞为T细胞时，所述T细胞为TCR-T细胞、CAR-T细胞、γ/δ-T细胞中的任意一种；所述T细胞为TCR-T细胞时，所述TCR-T细胞为经慢病毒转染的TCR-T细胞，或从血液中分离出的TCR-T细胞；所述免疫细胞为NK细胞时，所述NK细胞为CAR-NK中的任意一种；所述免疫细胞为巨噬细胞(macrophage)时，所述巨噬细胞(macrophage)为CAR-M细胞中的任意一种。
[0021]优选的，所述肿瘤或癌症为头颈部癌、黑素瘤、软组织肉瘤、乳腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、圆细胞型脂肪肉瘤中的任意一种。
[0022]本发明具有以下有益效果：本发明通过对VSV野生型病毒的基质蛋白M进行定点突变，提供了一种全新的溶瘤病毒减毒株，该减毒株可单独作为药物肿瘤，安全性与治愈率均优于野生型病毒及其它减毒株。该减毒株还可作为载体（骨架），与抗原或细胞因子等连接，从而将抗原或细胞因子等物质定点输送到所需位置，成为疫苗或药物；具体连接的抗原或细胞因子种类可根据实际需要的肿瘤或其它疾病种类而定，适应性强。本发明在所述溶瘤病毒减毒株的基础上，通过在减毒株内插入外源基因NY-ESO-1，还提供了一种可应用在肿瘤中的疫苗。所述疫苗治愈率高，且生物安全性高。本发明在所述疫苗的基础上，还将疫苗与TCR-T细胞联合应用，提供了一种可高效多类肿瘤的药物；在小鼠的肺癌模型上，治愈率可达到惊人的95%。
附图说明
[0023]图1为各减毒株在体外的LLC细胞和MEF细胞内复制能力示意图；
图2为各减毒株对体外的LLC细胞和Hela细胞杀伤能力示意图；
图3为各减毒株对体外的MEF细胞杀伤能力示意图；
图4为各减毒株对体外LLC细胞和MEF细胞内IFN-β表达水平影响示意图；
图5为溶瘤病毒疫苗构建示意图；
图6为各减毒株对小鼠体内非小细胞肺癌（移植瘤）体积大小影响示意图；
图7各疫苗对小鼠体内非小细胞肺癌（移植瘤）体积大小影响示意图；
图8为实验终点时，各减毒株和疫苗处理下小鼠体内非小细胞肺癌（移植瘤）体积大小示意图；
图9为各减毒株和疫苗对小鼠体内非小细胞肺癌细胞转移情况影响示意图；
图10各疫苗对小鼠体内纤维肉瘤（移植瘤）体积大小影响示意图；
图11为实验终点时，各疫苗处理下小鼠体内纤维肉瘤（移植瘤）体积大小示意图；
图12为各疫苗对小鼠体内黑素瘤（移植瘤）体积大小影响示意图；
图13为实验终点时，各疫苗处理下小鼠体内黑素瘤（移植瘤）体积大小示意图；
图14为不同剂量的JBS004对小鼠体内非小细胞肺癌（移植瘤）体积大小影响示意图；
图15为实验终点时，不同剂量的JBS004处理下小鼠体内非小细胞肺癌（移植瘤）体积大小示意图；
图16为不同剂量的JBS004对小鼠体内非小细胞肺癌细胞转移情况影响示意图；
图17为不同剂量的JBS004对肺癌小鼠的体重影响示意图；
图18为不同剂量的JBS004对肺癌小鼠的体温影响示意图；
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