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张超，栾兴社，朱明晟，孙娜，杨统见，王书燕
山东建筑大学市政与环境工程学院（济南 250101）
摘要研究了各种氨基酸对枯草芽孢杆菌发酵生产聚谷氨酸的影响。在发酵初始添加 3 g/L 天冬氨酸、1.5 g/ L苯丙氨酸和在对数生长期晚期添加7 g/L谷氨酸使聚谷氨酸产量分别提高12.6%，23.7%和31.7%。再用均匀设计法进一步优化。优化后的氨基酸添加量为：8 g/L谷氨酸、3.5 g/L天冬氨酸、1 g/L苯丙氨酸，γ-PGA产量达到37.92 g/L，与优化前得到的培养结果相比，提高了9.9%。关键词
枯草芽孢杆菌；氨基酸；聚谷氨酸；发酵
Stimulatory Effects of Some Amino Acids on γ-Polyglutamic Production by
Bacillus subtilis
Zhang Chao, Luan Xing-she, Zhu Ming-sheng, Sun Na, Yang Tong-jian, Wang Shu-yan School of Municipal and Environmental Engineering, Shandong Jianzhu University (Jinan 250101)
Abstract The effect of amino acid on production of γ-Polyglutamic by Bacillus subtilis Z-115 was investigated. The γ-Polyglutamic production was increased 12.6%, 23.7% and 31.7%, respectively, with 3 g/L aspartic acid, 1.5 g/L phenylalanine fed to the fermentation medium at the initial fermentation and 7 g/L glutamic acid at 24 h. Then, Uniform design was adopted for further optimization. The concentration of amino acids was obtained as follows: glutamic acid 8 g/L, aspartic acid 3.5 g/L, phenylalanine 1 g/L. Under such conditions, the γ-PGA production was increased to 37.92 g/L, which was 9.9% higher than the maximum value in the single factor tests.
Keywords Bacillus subtilis ；amino acid ；γ-Polyglutamic ；fermentation
聚谷氨酸（γ-PGA）是微生物产生的一种胞外氨基酸聚合物，是一种水溶性、可被生物降解的新型高分子材料，在食品、环保、医药、化工、化妆品等领域具有广阔的应用前景[1-4]。
氨基酸是一类重要的生长限制因子，可以促进微生物生长和代谢产物合成，已广泛应用于生化药物、酶
制剂、抗生素等众多发酵制品的生产过程[5-6]。在S. cerevisiae A发酵过程中，在以15%半乳糖为糖源的基础上，再添加 1%的酪氨酸可以明显提高其生物量和酒精产量[7]。在S. cerevisiae T65补料分批发酵生产谷胱甘肽（GSH）的研究中，先添加半胱氨酸，再添加谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸，生物量和胞外GSH的产量分别达到133 g/L和 1.88 g/L，GSH的产量为对照组的2.67倍[8]。
国外对微生物发酵法生产γ-PGA研究较早，美国、日本、韩国等一些发达国家对γ-PGA制备和应用的研究十分活跃，并取得了较大的进展，很多相关工艺和技术已形成专利[9-13]。但是，在氨基酸影响Bacillus subtilis 产γ-PGA发酵过程及其作用机理方面的研究，目前尚处于探索阶段，而且国内外有关同类研究的报道也极其匮乏。作者从腐乳中分离得到一株γ-PGA生产菌Bacillus subtilis Z-115，对常见氨基酸影响Bacillus subtilis Z-115的产γ-PGA发酵过程进行了详细研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 出发菌株
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）Z-115，由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂
甘氨酸、谷氨酸等氨基酸，上海生化技术公司产品；蔗糖、蛋白胨和氯化钠，中国医药（集团）上海试剂公司产品；乙醇，中国金山化工厂（上海）产品。
谷氨酸发酵液（8%）、等电结晶后的粗谷氨酸（80%）和味精粗品（90%），均由山东建筑大学生物工程实验中心提供。1.1.3 培养基
斜面培养基（g/L）：蔗糖20，蛋白胨10，氯化钠5，谷氨酸钠20，琼脂18，pH 7.0。
种子培养基（g/L）：蔗糖20，蛋白胨10，氯化钠5，谷氨酸钠20，pH 7.0。
发酵培养基（g/L）：蔗糖40，蛋白胨25，氯化钠15，谷氨酸钠35，pH 7.0。1.2 方法
1.2.1 发酵方法
每株菌取一满环接入到30 mL发酵培养液中（250
研究探讨
120
mL三角瓶），摇床培养24 h，然后按1%的接种量转入3个250 mL三角瓶中，37 ℃摇床培养48 h。1.2.2 分析方法1.2.2.1 pH测定
PHSJ-4A型数字pH计测定。
1.2.2.2 发酵液中γ-PGA含量的测定
发酵液加入1倍体积水摇匀。10 000 r/min离心10 min除去菌体，上清液加入2.5倍体积无水乙醇，摇匀，10 000 r/min、5 min离心得沉淀，沉淀用蒸馏水溶解，透析过夜，透析液加2倍体积无水乙醇，得到的沉淀物在105 ℃干燥，称质量[14]。1.2.2.3 菌浓测定
生物量的检测采用光密度法，取发酵液经10 000 r/min离心10 min，上清液取至另一离心管用于γ-PGA 的检测，菌体沉淀经洗涤两次，稀释到合适的浓度，以蒸馏水作参比，在波长600 nm下测定其吸光度。1.2.3 试验设计 在单因素试验的基础上，采用均匀设计法进一步优化[15]。共3个因素，各因素均为7水平，设计U 7(73)表，其中：发酵温度37 ℃，转速200 r/min，发酵装液量30 mL/250 mL三角瓶，发酵培养48 h。每一组设3个平行试验，取平均值。
2 结果与讨论
2.1 常见氨基酸对聚谷氨酸发酵的影响
考察了各种常见氨基酸对Bacillus subtilis Z-115发酵生产γ-PGA的影响，结果见表1。依据γ-PGA 产量提高的程度，将各种氨基酸的作用分为以下4类：（1）天冬氨酸和苯丙氨酸能显著提高γ-PGA的产量（10%）；（2）谷氨酸、精氨酸和缬氨酸能促进γ-PGA的合成（5%~10%）；（3）丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和组氨酸则对γ-PGA合成没有明显的促进作用（0%~5%）；（4）谷氨酰胺和赖氨酸对细胞生长和γ-PGA的合成表现出一定的抑制作用。
表1 氨基酸对γ-PGA发酵的影响
氨基酸添加量/(g・L -1)OD 600γ-PGA/(g・L -1)γ-PGA增产率
/%
对照00.5526.2L-甘氨酸10.5727 3.12L-丝氨酸10.5026.9 2.79L-谷氨酸10.5928.27.65L-谷氨酰胺10.4522.7-13.54L-组氨酸10.5126.40.78L-脯氨酸10.5026.6 1.46L-酪氨酸10.5026.5 1.09L-赖氨酸10.4925.9-1.23L-天冬氨酸10.6129.512.43L-天冬酰胺10.4826.40.69L-异亮氨酸10.5026.20.00L-苯丙氨酸10.5928.810.01L-精氨酸10.5728.48.3L-缬氨酸
1
0.58
27.7
5.6
2.2 氨基酸添加时间对γ-PGA合成的影响
根据表1，选择对γ-PGA合成影响较大的谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸进一步研究，考察其添加时间对γ-PGA合成的影响。添加时间分别为发酵初始（0 h）、对数生长期早期（12 h）、对数生长期晚期（24 h）、稳定期（36 h）和发酵结束（48 h）。由图2可知，在发酵初始时添加天冬氨酸、苯丙氨酸和在对数生长期晚期添加谷氨酸可以促进γ-PGA
合成。
图2 谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸添加时机对
γ-PGA合成的影响
2.3 氨基酸浓度对聚谷氨酸发酵的影响
考察了不同浓度的氨基酸对γ-PGA产量的影
响，结果见图3。
图3 氨基酸对γ-PGA产量的影响
由图3可知，谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸相应的最佳添加浓度分别为7 g/L，3 g/L和1.5 g/L。
2.4 适宜条件下添加外源氨基酸的聚谷氨酸发酵过程
在最适添加时间和添加浓度下，谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸对Bacillus subtilis Z-115的γ-PGA生产过程的影响如图4。发酵48 h时γ-PGA产量比对照分别提高了31.7%，23.7%和12.6%。
研究探讨
121
图4 添加氨基酸对γ-PGA产量的影响2.5 均匀设计确定外源氨基酸最佳添加浓度2.5.1 均匀设计试验方案及试验结果
根据以上单因素试验结果，采用均匀设计表中的3因素7水平试验7组方案，研究培养基中谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸对γ-PGA产量的影响。试验设计方案和结果如表2所示。
表2 U 7(73)均匀设计及试验结果
试验号1(g・L -1)2(g・L -1)3(g・L -1)(g・L -1)142 1.516.33253329.49364114.2747 1.5 2.522.9058 2.50.535.4169 3.5223.437
10
4.5
3.5
28.70
2.5.2 试验数据的回归分析和方程建立
试验结果经DPS 3.01软件数据处理，得出回归方程：
Y =24.85-0.020 29X 1+1.443X 2-10.115X 3+0.004X 1X 3-0.000 01X 22+0.001 95X 2X 3
其中，R =0.9984，F =74.752，显著水平p =0.027＜0.05，回归方程变量间关系是极显著的。对应的最优氨基酸添加浓度：8 g/L谷氨酸、3.5 g/L天冬氨酸、1 g/L苯丙氨酸，预测最优结果为38.12 g/L。2.5.3 验证试验
在最优条件下进行验证试验，结果见表3。
表3 优化方案验证试验结果
指标
预测值试验值误差/%γ-PGA/(g・L -1)
38.12
37.92
0.005
由表3可以看出：试验值与预测值的误差在允许范围之内，说明均匀设计优化的结果准确可信。在最适氨基酸添加浓度条件下培养48 h，γ-PGA产量达到37.92 g/L，与优化前得到的培养结果（24 h时添加7 g/L谷氨酸）相比，提高了9.9%。
2.6 不同来源的谷氨酸对γ-PGA发酵的影响
由于Bacillus subtilis Z-115以谷氨酸钠为前体合成γ-PGA，所以谷氨酸钠用量非常大，使得生产成本居高不下，因此考虑利用价格比较低廉的前体代替精制的味精。研究了三种前体替代物：谷氨酸发酵液、等电结晶后的粗谷氨酸和结晶后的味精粗品。前体替代物的添加量均以对照样（35 g/L谷氨酸钠+8 g/L谷氨酸）进行换算，添加相应的浓度。
表4 谷氨酸替代物对γ-PGA发酵的影响
前体物生产强度/[g・(L・h)-1]
OD 600γ-PGA/(g・L -1)谷氨酸发酵液0.320.4417. 52粗谷氨酸0.740.6236.76味精粗品0.760.6436.25对照
0.79
0.67
37.92
由表4可知，等电结晶后的粗谷氨酸和结晶后的味精粗品均是很理想的谷氨酸替代物。以粗谷氨酸为替代物，生产强度低一点、产量高，味精粗品为替代物的效果反之，但生产强度与产量相差不大。而以谷氨酸发酵液作为前体的效果最差，可能是由于发酵液中的成分比较复杂，干扰了γ-PGA的生产。
3 结论
1) 在枯草芽孢杆菌Z-115培养基中于发酵起始时添加适量天冬氨酸（3 g/L）、苯丙氨酸（1.5 g/L）和在对数生长期晚期添加谷氨酸（7 g/L）可使γ-PGA 产量分别提高12.6%，23.7%和31.7%。
2) 利用均匀设计法优化最适氨基酸添加浓度，结果为8 g/L谷氨酸、3.5 g/L天冬氨酸、1 g/L苯丙氨酸，γ-PGA产量达到37.92 g/L，与优化前得到的培养结果（24 h时添加7 g/L谷氨酸）相比，提高了9.9%。
3) 等电结晶后的粗谷氨酸和结晶后的味精粗品均是很理想的谷氨酸替代物。
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研究探讨
122
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大鲵粗提物延缓秀丽线虫衰老的研究
黄正杰1,2，崔建云1,2*，任发政1,2,3，赵慧1,3
1.中国农业大学食品科学与营养工程学院；
2.教育部—北京市共建功能乳品重点实验室；
3.北京市高等学校畜产品工程研究中心（北京100083）
摘要试验研究了人工养殖大鲵粗提物延缓秀丽线虫衰老的功能性质，从而为科学的认识大鲵的营养保健功
能提供理论依据。通过测定秀丽线虫寿命、后代数、虫体大小及线虫的急性热应激和急性氧应激能力，评价了大鲵粗提物的延寿抗衰老功效并探讨了大鲵粗提物延缓衰老作用机理。试验结果表明，浓度50 mg/L的大鲵粗提物可以提高线虫寿命，对大鲵生殖能力没有影响。关键词
大鲵；粗提物；秀丽线虫；延缓衰老
Study on Anti-aging Effects of Crude Extract of Giant Salamander on
Caenorhabditis elegans
Huang Zheng-jie 1,2, Cui Jian-yun 1,2*, Ren Fa-zheng 1,2,3, Zhao Hui 1,3
1.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University ；
2.Key Laboratory of Functional Dairy ；
3. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product (Beijing 100083)
Abstract The functional properties of anti-aging effects of crude extract of Giant salamander on Caenorhabditis elegans was studied, so as to provide a theoretical basis for scienti fi c understanding of the nutritional properties of giant salamander. The anti-aging effect and probed anti-aging mechanism of crude extract of Giant salamander on Caenorhabditis elegans have been evaluated by measuring the C. elegans life span, number of posterity, size and the ability of acute heat stress and the ability of acute oxidative stress. The results showed that a certain concentration crude extract of Giant salamander can increase life span of Caenorhabditis elegans and has no effects on the reproductive capacity of Caenorhabditis elegans .Keywords Giant salamander; crude extract; Caenorhabditis elegans ; anti-aging
中国大鲵俗称娃娃鱼，是我国特有的珍惜大型两栖动物，隶属两栖纲，有尾目，隐腮鲵科，大鲵属，具
有很高的生理保健和食用营养价值。中国传统医学认为大鲵干、平、补气、养血、益智、滋补，可以增强免疫力，延缓衰老[1]。本研究通过引入秀丽隐杆线虫这一新型抗衰老评价模型，利用其易于饲养、易于同期化且易开展大规模研究等优点，首次研究了大鲵粗提物延缓秀丽线虫衰老的作用，快速评价大鲵的抗衰老功能作用，并探讨其作用机理。
1 试验材料与试剂
1.1 试验材料
秀丽线虫虫株：野生型Caenorhabditis elegans N2，北京生命科学研究所（NIBS）王晓晨实验室惠赠；
菌株：线虫标准食物E.coli OP50，NIBS王晓晨实验室惠赠；
大鲵，由某养殖基地提供。1.2 试验试剂
五氟尿嘧啶（FUDR）：美国Amresco公司；二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma-Aldrich公司；其余未注明试剂为国产生化或分析纯试剂。1.3 培养基及试剂配制[2]
M9缓冲液：3 g KH 2PO 4，15.12 g Na 2HPO 4・12H 2O，5 g NaCl，加蒸馏水定容至1 L，121℃灭菌15 min，冷却
研究探讨
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