(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.23
C N 103940936
A (21)申请号 201410026879.7
(22)申请日 2014.01.20
G01N 30/88(2006.01)
(71)申请人天津市敬业精细化工有限公司
地址300270 天津市滨海新区（大港）石化产
业园区渤海精细化工基地内天津市敬
业精细化工有限公司
(72)发明人彭久合 吴丹 张铁柱
(74)专利代理机构天津市新天方有限责任专利
代理事务所 12104
代理人
李桂英
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中
痕量L-脯氨酸的检测方法，属于分析领域。本发
明是利用4α-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸与氯
外吸收的特性，然后再用高压液相谱仪进行检
测分析。本发明具有衍生时间短、能耗低、反应条
件温和，操作简便、安全、高效，专属性、重复性及
准确好，灵敏度高等优点。本方法适合工业化生产
中4α-羟基-L-脯氨酸的快速检验。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书8页 附图3页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页 附图3页(10)申请公布号CN 103940936 A
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1.一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，其包括以下步骤：
（1）取4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸对照品加水溶解，制得4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液； （2）取4α-羟基-L-脯氨酸样品加水溶解，制得样品溶液；
（3）将步骤1及步骤2所得混合标准品溶液及样品溶液分别加入氯甲酸对硝基苄酯二氯甲烷溶液，混匀，静止后分别取上层溶液稀释，得衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；
（4）吸取步骤3获得的衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液注入液相谱仪中，进行4α-羟基-L-脯氨酸测定，其中，谱条件为：
流动相：0.1%磷酸水溶液：乙腈=1:1（v/v ）；
谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm ；
流速：1.0mL/min ；
进样量：5μL ；
检测器：VWD ；
（5）根据步骤4所得的谱图计算4α-羟基-L-脯氨酸样品中4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1具体为称取2g4α-羟基-L-脯氨酸对照品及10mg L-脯氨酸对照品置于25ml 容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2具体为称取0.8g4α-羟基-L-脯氨酸样品置于10ml 容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3具体为取步骤1制得的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液及步骤2制得的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液0.5ml ，分别置于2个25ml 容量瓶中，再分别加入0.5ml50%氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烷溶液，强力振荡10min ，再分别加入1ml1mol/L NaOH 振荡1min ，最后加纯化水稀释至刻度，静止备用。权 利 要 求 书CN 103940936 A
一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方
法
技术领域
[0001] 本发明属于分析领域，涉及一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法。
背景技术
[0002] 4α-羟基-L-脯氨酸是合成多个第二代碳青霉烯类抗生素及其它药物的起始原料，现行制备4α-羟基-L-脯氨酸的生产工艺不可避免地会伴生痕量的L-脯氨酸，而L-脯氨酸会参与后续反应，产生影响最终产物含量的杂质。4α-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸均为环烷羧酸，结构中无紫外发基团，因此无法直接用具紫外检测器的高压液相谱仪检测其纯度和含量。
[0003] 4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的分析检测方法主要有化学比法、电泳法、氨基酸分析仪测定法、高效液相谱法、液质联用法等。化学比法、电泳法及氨基酸分析仪法操作复杂，分析时间短，分析时间长，价格昂贵。液质联用法仪器普及性不广。而柱前衍生与高效液相谱相结合具有其操作简单、分析时间短，方法灵敏、线性范围宽，结果准确可靠及普及型广等优点，因此是分析检测4α-羟基-L-脯氨酸的最有力工具。[0004] 高效液相谱柱前衍生4α-羟基-L-脯氨酸常用的衍生剂有异硫氰
酸苯酯(PITC)、2,4二硝基氟苯(DNFB)、9-芴基甲氧羟酰氯(FMOC)等。但是异硫氰酸苯酯(PITC)操作较复杂，且衍生化时间过长；2,4二硝基氟苯(DNFB)室温下即融化，影响操作，且衍生出的副产物影响分离结果；9-芴基甲氧羟酰氯(FMOC)易水解，影响分离，效果欠佳。因此目前，对4α-羟基L-脯氨酸的分析检测缺乏快速、准确的方法。
发明内容
[0005] 本发明提供一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，即一种衍生方法工时短、能耗低、工艺条件温和，操作简便、安全、高效，灵敏度高的检测4α-羟基-L-脯氨酸的新的方法。
[0006] 为实现上述的发明目的，本发明采取的实施方式如下：
[0007] 一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法，其包括以下步骤：[0008] （1）取4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸对照品加水溶解，制得4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液；
[0009] （2）取4α-羟基-L-脯氨酸样品加水溶解，制得样品溶液；
[0010] （3）将步骤1及步骤2所得混合标准品溶液及样品溶液分别加入氯甲酸对硝基苄酯二氯甲烷溶液，混匀，静止后分别取上层溶液稀释，得衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；
[0011] （4）吸取步骤3获得的衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸混合标准品溶液和衍生化后的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液注入液相谱仪中，进行4α-羟基-L-脯
氨酸测定，其中，谱条件为：
[0012] 流动相：0.1%磷酸水溶液：乙腈=1:1（v/v）；
[0013] 谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm；
[0014] 流速：1.0mL/min；
[0015] 进样量：5μL；
[0016] 检测器：VWD；
[0017] （5）根据步骤4所得的谱图计算4α-羟基-L-脯氨酸样品中4α-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸含量。
[0018] 具体为称取2g4α-羟基-L-脯氨酸样品置于25ml容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，制得4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液；取制得的4α-羟基-L-脯氨酸样品溶液0.5ml，置于25ml容量瓶中，加入0.5ml50%氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烷溶液，强力振荡10min，再加入1ml1mol/L NaOH，振荡1min，
最后加纯化水稀释至刻度，静止备用。得到对应的衍生物1-对硝基苄氧羰基-4α-羟基-L-脯氨酸钠(痕量的1-对硝基苄氧羰基-L-脯氨酸钠)，该衍生物均具有紫外吸收，再用高压液相谱仪进行检测分析。
[0019] 本发明所涉及部分化合物的结构式：
[0020] 4α-羟基-L-脯氨酸的结构式如下所示
[0021]
[0022] L-脯氨酸的结构式如下所示
[0023]
[0024] 氯甲酸对硝基苄酯的结构式如下所示
[0025]
[0026] 1-对硝基苄氧羰基-4α-羟基-L-脯氨酸的结构式如下所示
[0027]
[0028] 1-对硝基苄氧羰基-L-脯氨酸的结构式如下所示
[0029]
[0030] 本发明的反应原理如下：
[0031]
[0032] 本发明的有益效果是：采用本发明所述的方法，工时短、能耗低、工艺条件温和，操作简便、安全、准确，高效，重现性好，灵敏度高。
[0033] 为了便于描述，4α-羟基-L-脯氨酸下述简称羟脯氨酸，L-脯氨酸下述简称脯氨酸，氯甲酸对硝基苄酯下述简称PNZ。
附图说明
[0034] 图1是未加羟脯氨酸直接衍生化的空白图谱；
[0035] 图2是羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液0.5ml直接衍生化的图谱；
[0036] 图3是羟脯氨酸样品溶液0.5ml直接衍生化的图谱；
[0037] 图4是实施例6的羟脯氨酸线性关系图；
[0038] 图5是实施例6的脯氨酸线性关系图。
具体实施方式
[0039] 下面结合附图对本发明的具体实施方式做出详细说明。
[0040] 仪器与试药
[0041] 仪器：岛津LC-10ATvp高效液相谱仪，SPD-10Avp紫外检测器，LC Solution数据工作站；超声波清洗器；AL204分析天平（METTLER）；谱柱：Agilent HC-C18,4.6×250mm,5μm。
[0042] 试药：羟脯氨酸对照品（批号：111578-200201）及脯氨酸对照品（批号：140677-200405）由中国药品生物制品检定所提供（供含量测定用），羟脯氨酸样品（批号：20120705）由河北冀海生物科技有限公司提供；乙腈为谱纯；50%PNZ为我公司自制产品；其他试剂为分析纯；水为纯净水。
[0043] 实施例1制备羟脯氨酸及脯氨酸混合标准品溶液
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