(10)申请公布号 CN 102558312 A
(43)申请公布日 2012.07.11C N 102558312 A
*CN102558312A*
(21)申请号 201210031359.6
(22)申请日 2012.02.13
C07K 14/02(2006.01)
C12N 15/51(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/576(2006.01)C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人中山大学
地址510275 广东省广州市海珠区新港西路
135号
(72)发明人王一鸣 黄玮俊 彭亮 赵强
李奇斌 裴元元 袁萍 高志良
(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限
公司 44102
代理人
陈卫
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种慢性乙型病毒性肝炎相关
基因NLRX1的新突变蛋白、编码基因及其应用。
本发明的慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的
新突变蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因
NLRX1蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸突变为
半胱氨酸，同时得到了该突变蛋白的编码基因，建
立了基于NLRX1基因及其突变体的诊断试剂盒，
该试剂盒可以对临床上慢性乙肝患者进行基因水
平的诊断，还可以对其临床用药情况予以指导和
个体化。从长远看，对慢性乙型病毒性肝炎进
行NLRX1基因的突变检测使我们有可能在今后通
过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生
物学效应的方法去本病，在临床方面有
深远意义和应用前景。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页序列表10页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 4 页序列表 10 页 附图 1 页
1/1页
1.一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白，其特征在于在慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸突变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求2所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.权利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
6.权利要求4所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
7.一种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于由以下成分组成：核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR 反应液，PCR 产物纯化盒和测序反应液；
所述PCR 反应液为溶解了Tag DNA 聚合酶、dNTPs 、镁离子的PCR 反应缓冲液（内含(NH 4)2SO 4）；
所述PCR 产物纯化盒由纯化PCR 产物的溶液和DNA 吸附柱Labell 组成，所述纯化PCR 产物的溶液为1u/μL 虾碱性磷酸酶、20u/μL 外切酶Exo I 和灭菌ddH 2O 的混合液；
所述测序反应液为BigDye 和5×Sequence buffer 的混合液。
8.根据权利要求7所述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物浓度分别为3.2μmol/L 。权 利 要 求 书CN 102558312 A
一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白、
编码基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程及医学技术领域，具体涉及一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白、编码基因及其应用。
背景技术
[0002] 慢性乙型病毒性肝炎（慢性乙肝）是由乙型肝炎病毒（HBV）感染而引起的以肝脏损害为主要表现的传染性疾病，是关系到我国乃至全球公共卫生的重大疾病。宿主的遗传背景在其易感性及免疫应答中起重要作用。而人对乙肝免疫力的高低存在明显的个体差异。[0003] 中国专利200810004159.5公开了一种与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物以及预测HBV感染个体发展成肝细胞癌(HCC)的遗传素因的试剂盒。该试剂盒包括一种或更多种探针，当其与HBV基因组接触时，如果所述基因组为NLRX1基因型、且包括至少一种对应于某段核苷酸序列上的核苷酸（170C；和/或2170G2；和/或2441C；和/或799G）时会选择性地与所述基因组杂交。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白。[0005] 本发明的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白的编码基因。
[0006] 本发明的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白、该突变蛋白的编码基因的应用。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白，是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸Arg突变为半胱氨酸Cys，本发明中用p.Arg707Cys表示。
[0008] 上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009] 上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白的编码基因。该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。
[0010] 慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
[0011] 慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
[0012] 一种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，由以下成分组成：核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反应液，PCR产物纯化盒和测序反应液；
）、PCR反应缓冲液所述PCR反应液为溶解了Tag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子（如MgCl
2
（如10×Taq Buffer），以上试剂均可直接购买相应商品，如（10mM）dNTPs购自上海生工生物
工程技术服务有限公司；Tag DNA聚合酶及其配套的10×Taq Buffer、MgCl
2
购自Fermentas 公司。各试剂的用量及浓度均为本领域常规值，如1u/μL Tag DNA聚合酶1μL、2mmol/L
的dNTP（即浓度均为2mmol/L 的4种dNTP的混合物）3μL、25mmol/L MgCl
2
3μL、10×Taq
Buffer（内含(NH
4)
2
SO
4
）3μL、灭菌ddH
2
O 17μL。
[0013] 所述PCR产物纯化盒为纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell；所述纯化PCR 产物的溶液为：1u/μL虾碱性磷酸酶（SAP，可购于Fermentas公司）0.6μL、20u/μL外切酶（Exo I，可购于Fermentas公司）0.15μL和灭菌ddH
2
O 1.25-1.75μL，或按上述比例配制的其他体积的混合液。纯化PCR产物的溶液优选2-2.5μL。
[0014] 所述测序反应液为BigDye（购自ABI公司）和5×Sequence buffer（购自ABI 公司）的混合液，Bi
gDye和5×Sequence buffer的体积比优选为1:2，如1μLBigDye与2μL5×Sequence buffer混合。
[0015] 上述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，优选核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物浓度分别为3.2μmol/L。
[0016] 本发明的慢性乙型病毒性肝炎的相关基因NLRX1及其新突变p.Arg707Cys，是通过对“相对极端性状的”50例慢性乙肝患者及40例未注射过乙肝疫苗正常对照进行全基因组外显子测序，通过生物信息学分析及进一步的数据筛选到最有可能的候选基因；然后再对所到的候选基因进行大样本量的病例-对照（其中慢性乙肝患者1728例，未注射乙肝疫苗正常对照1636例）相关关系研究；最后通过相关基因的作用机理及统计学分析结果（NLRX1基因新突变与慢性乙肝相关的统计学P值为5.08×10-5，优势比（OR）为2.34，说明两者有显著相关性）最终确定了NLRX1基因新突变与慢性乙型肝炎相关。
[0017] 本发明的人NLRX1基因核苷酸全长序列（包含突变位点）通常是用聚合酶链式反应（PCR）进行合成。对于PCR扩增法，可根据NLRX1基因的核苷酸序列，进行引物设计，并以所检测的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作为模板，扩增目的序列。最后通过测序反应检测及确定相关基因的突变。
[0018] 由于前期的研究已经证明了慢性乙型肝炎与NLRX1基因新突变的高度相关性，因此检测这个基因的突变可用于鉴定慢性乙型肝炎患者的宿主遗传背景的易感性及对免疫应答的反应能力，进一步地用于之后靶向个体化。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
我们通过全基因组外显子测序及大样本量的相关研究，发现了与慢性乙型病毒性肝炎的相关基因——NLRX1及其新突变。因此，寻及检测慢性乙肝相关基因及其突变，不仅是了解及阐明本病的发病机理的必要途径，同时也为建立鉴定本病的基因诊断和个体化提供了新的契机。在已了解与本病相关的NLRX1基因及其突变之后，我们可以建立起基于NLRX1基因及其变异的诊断技术，以期对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断，还可以对其临床用药情况予以指导和个体化。由于基因的突变是导致本病遗传背景发生改变从而致使其易感性及免疫应答发生改变的重要因素，从长远看，对本病进行NLRX1基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法去本病。因此，从长远看，与本病相关的NLRX1基因突变的发现在临床方面有深远的意义和前景。
附图说明
[0020] 图1：NLRX1基因的部分测序结果，图中上部为NLRX1野生型的测序结果，图下部为NLRX1 p.Arg707Cys杂合性突变的测序结果（箭头所示为突变位点）。
具体实施方式
[0021] 以下实施例中如无特殊说明均为本领域常规试剂和试验方法。
[0022] 实施例1 病例收集
来自中山大学附属第三医院传染科的1728例慢性乙型肝炎患者和来自同一地区的1636例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者，在取得上述患者、自愿者及家属知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中备用。用Qiagen公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kits（试剂盒）从抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，-80℃保存，备用。[0023] 实施例2 NLRX1基因的突变检测
NLRX1基因的mRNA序列来自Genbank（NM_170722）。Genomic DNA序列来自UCSC数据库（genome.ucsc.edu/）和Ensembl数据库（/index. html）。
[0024] 主要步骤：
1. PCR扩增：PCR反应体积为30μL：10×Taq Buffer（内含(NH
4)
2
SO
4
）3μL，25mmol/
L MgCl
2
3μL，2mmol/L dNTP混合物3μL，3.2μmol/L上、下游引物各1μL，1u/μL Taq
DNA聚合酶1μL，实施例1提取的DNA模板1μL，灭菌ddH
2
O补足体积至30μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃30s，引物特异性退火温度1min，72℃45s，36个循环；最后72℃延伸10min。
[0025] 检测NLRX1基因突变位点的上游引物P1（SEQ ID NO：3）的序列为：5’- CCCCATCAGAGCTCCTTGACC-3’，下游引物P2（SEQ ID NO：4）的序列为：5’- CTCCCGGCCCCTAAACTAGACT-3’。
[0026] 2. 测序反应方案
（1）预反应：反应体积共3μL：1u/μL虾碱性磷酸酶（SAP）0.6μL、20u/μL外切酶
（Exo I）0.15μL （Fermentas公司）、PCR产物0.5-1.0μL、灭菌ddH
2
O补足体积至3μL。反应混合物在PCR仪上反应，37℃温浴15min，85℃ 15min灭活酶。反应完毕后反应混合物直接作为测序反应的模板用。
[0027] （2）测序反应：用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700 PCR仪上进行。反应体积共10μL：3μL的预反应产物、2μL的5×Sequence buffer（ABI公司）、1μL的Big-Dye
（ABI公司）、1μL的引物（3.2μmol/L），3μL的灭菌ddH
2
O。反应条件：98℃2min；96℃10s，50℃ 5s，60℃ 4min，30个循环；最后4℃保存。
[0028] （3）测序纯化：直接在96孔板上进行。
[0029] a) 测序反应完毕后，配无水乙醇6mL+3mol/L醋酸钠（pH5.2）240μL混合溶液（即无水乙醇：醋
酸钠体积比=25:1），每个样品中加入50μL混合溶液。用锡箔纸封闭，并振荡混匀。
[0030] b) 将测序产物放于-20℃避光静置20min以上。
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