[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1594581A [43]公开日2005年3月16日
[21]申请号200410028107.3[22]申请日2004.07.16
[21]申请号200410028107.3
[71]申请人深圳大学
地址518060广东省深圳市南山区南油大道2336
号
[72]发明人刘志刚 吉坤美 喻海琼 高波 张红云 [51]Int.CI 7C12N 15/62C12N 15/12C12N 15/52
C12N 15/81
C12P 21/02
权利要求书 1 页 说明书 13 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明涉及一种基因工程重组技术制备人脑利
钠肽的方法。通过人工合成人脑利钠肽BNP活性部
位32个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的
CMP－3－脱氧－D－甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′
端融合，中间含肠激酶识别切割位点，该融合基因
克隆至甲酵营养型酵母Pichia表达载体获得该融合 基因高效表达的工程酵母菌株，该工程菌经发酵后
提取层析纯化制备融合蛋白，再经肠激酶切割后分
离纯化获得重组人脑利钠肽。该重组肽经体外试验
表明具备人脑利钠肽BNP生物活性。
200410028107.3权 利 要 求 书第1/1页 1、一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法，包括以下步骤：通过人工合成人脑利钠肽BNP活性部位的32个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合，中间含肠激酶识别切割位点，该融合基因克隆至酵母表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株，该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白，再经肠激酶切割后分离纯化获得重组人脑利钠肽。
2、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法，其特征在于融合基因序列为SEQ ID NO.1。
3、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法，其特征在于突变改造的CMP-3-脱
氧-D-甘露-六酮糖酸合成酶CKS，突变位点在于SEQ ID NO.2中的氨基酸序列219位由原甲硫氨酸Met突变为苏氨酸Thr。
4、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法，其特征在于融合蛋白为SEQ ID NO.2。
5、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法，其特征在于表达载体为含有SEQ ID NO.1序列的表达载体。
6、根据权利要求1或5所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法，其特征在于表达载体为甲酵营养型宿主酵母P i c h i a。
200410028107.3说 明 书第1/13页一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种重组技术制备人脑利钠肽的方法。
背景技术
心脑血管疾病是世界公认的人类健康的“第一杀手”。在我国每年所有死亡人数中心脑血管疾病死亡占20％左右。心脑血管疾病种类
繁多，其中心力衰竭是许多心脏疾病的终结阶段。
心力衰竭是一组临床上较为常见的心血管综合症，是多数器质性心脏病人几乎不可避免的结局。高血压性心脏病、冠心病、心肌梗塞、风湿性心脏病、肺源性心脏病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心肌炎、心动过速心肌病、糖尿病性心肌病、甲亢性心脏病、酒精性心肌病、克山病、先天性心脏病等心血管疾病，发展到一定阶段，均可出现心力衰竭。
心力衰竭具有较高的死亡率，和恶性肿瘤相近。研究表明心衰的2年死亡率达20％，5年死亡率达40％，重度心衰的死亡率更高。更
为严峻的是心衰不仅死亡率高，而且发病率也远远高于恶性肿瘤。据WHO测算全世界心衰发病率将近2％。在美国有470万慢性心衰患
者，并且每年有55万新诊断的心衰患者。美国每年用于心衰的
费用达到210亿美元，包括158亿美元的住院费用。这一疾病的
医药开支费用远远超过所有恶性肿瘤费用的总和。我国心衰患者目前已达到500万人以上。随着我国人口老年化和高血压、高血脂、糖尿病和冠心病等患者的人数不断增加，在未来五年我国心衰患者将达到700万人以上。
在我国临床上心力衰竭的药物有强心剂、利尿剂、扩张血管剂、血管紧张素酶抑制剂、肾上腺素阻滞剂等几大类药物。但存在剂量不稳定、毒副作用大等缺点。因此开发一种效果优良、剂量稳定、毒副作用小的新药是非常迫切和必要的。
鉴于充血性心力衰竭是严重威胁人类健康及生命的疾病之一，美国FDA于2001年批准了SCIOS公司基因工程重组人脑利钠肽(BNP)
上市，用于急性充血性心衰。人脑利钠肽(BNP，human brain
n a t r i u r e t i c p e p t i d e)是人体的一种内源性激素，活性部位含32个氨基酸，其序列为S e r P r o L y s M e t V a l G l u G l y S e r G l y C y s P h e G l y A r g L y s M e t A s p A r g I l e S e r S e r S e r S e r G l y L e u G l y C y s L y s V a l Leu Arg Arg His，内含一对二硫键。SCIOS公司是通过大肠杆菌基
因重组表达生产的，每支含1.5毫克，分子量为3464，商品名为
Natrecor。BNP具有显著的疗效和很大的市场潜力。SCIOS公司的
BNP上市后的第二年(2002年)就销售了1亿七百三十万美元。
人脑利钠肽(BNP)在1988年首先由Sudoh从猪脑组织中分离出
来，是内源性利钠肽家族的重要成员之一，主要由心脏分泌，其中
60％-80％来自于心室肌细胞，具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素、
醛固酮分泌等作用。人脑利钠肽的主要作用与血管和肾脏的血流动力学平衡有关。大量的国内外临床试验结果表明，人脑利钠肽并不直接增强心肌收缩力，它主要通过降低外周血管阻力，降低心脏前后负荷，通过利钠、利尿作用降低体液负荷，提高心排血量，综合改善心脏功能，并且在体内能抑制血液中肾上腺素-血管紧张素系统的激活，同时也抑制了由于血管扩张效应引起的反射性心率增加，避免心率失常的发生。因此，人脑利钠肽在综合改善心肌作用的同时，不增加心肌耗氧，也不存在许多化学药物的不良反应。
S c i o s公司生产人脑利钠肽采用的是大肠杆菌基因表达的技术。大肠杆菌基因表达容易形成包涵体，其空间结构杂乱无章，没有生物学活性，必须经体外变性、复性分离而得到有活性产物。一方面，大肠杆菌表达分离的产物残留热原往往会引起发热等副反应，另一方
面，包涵体体外变性、复性分离得到的重组蛋白由于构象折叠很难完全恢复到天然结构并且有变性剂等
苛刻分离条件的使用会引起一些
氨基酸细微结构的变化从而影响药品的疗效和副反应。
我们所采用的酵母真核基因工程表达可溶性、具有生物活性的人脑利钠肽，在技术上避免了大肠杆菌原核表达易形成包涵体的缺点，具有生产过程简单、回收率高、生产成本低的优点，同时避免了大肠杆菌内毒素热原的污染、克服了大肠杆菌包涵体的变复性过程对目的蛋白活性的影响等缺点。国内外尚没有正式报道用酵母真核基因工程表达具有生物活性的人脑利钠肽。
发明内容
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