(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810775570.6
(22)申请日 2018.07.16
(71)申请人 辽宁中医药大学
地址 110847 辽宁省沈阳市皇姑区崇山东
路79号
(72)发明人 陈文娜 丛培玮 李曦明 郭胜男
曲静 苗兰英 刘海英
(74)专利代理机构 沈阳亚泰专利商标代理有限
公司 21107
代理人 陈铮
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6883(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
一种辅助诊断高脂血症及动脉粥样硬化的
试剂盒
(57)摘要
本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一
种miR -125a -3p的逆转录引物，上游引物和辅助 诊断高脂血症及动脉粥样硬化的试剂盒。miR -
CUGGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACGUCCAGGG
UCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGGGGCTCCCA -3’
(SEQ ID3)。利用本发明的试剂盒可对高脂血症
及动脉粥样硬化相关性疾病患者的miR -125a -3p 应用前景。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页CN 108823304 A 2018.11.16
C N 108823304
A
1.一种m i R -125a -3p的逆转录引物，其特征在于，该逆转录引物序列为：5’- CUGGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACGUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGGGGCTCCCA -3’(SEQ ID3)。
2.根据权利要求1所述的一种miR -125a -3p的逆转录引物，其特征在于，所述miR -125a -3p为人源miR -125a -3p （has -miR -125a -3p , MIMAT0004602）或鼠源 miR -125a -3p （mmu -miR -125a -3p, MIMAT0004528）。
3.一种miR -125b -3p的特异性引物，其特征在于，该特异性引物的序列为：
上游引物序列：5’- ACAGGTGAGGTTCTTG -3’(SEQ ID4)。
4.一种辅助诊断高血脂及动脉硬化的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下组分：权利要求1所述的特异性10×miRNA逆转录引物、权利要求3所述的20×miRNA 上游引物、20×miRNA 通用引物、4×One step miRNA RT Solution、 5×SYBR Green qPCR Mix、50×ROX Reference Dye。
5.根据权利要求4所述的一种辅助诊断高血脂及动脉硬化的试剂盒，其特征在于，所述miRNA 通用引物序列为5’- ACCTGTGAGGACGTCCAGG -3’(SEQ ID5)。
6.一种如权利要求4所述的辅助诊断高血脂及动脉硬化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法，
包括如下步骤：
（1）提取细胞中的RNA后，利用本试剂盒中的miRNA逆转录引物及逆转录试剂（4×One step miRNA RT Solution ）进行逆转录，具体条件为37℃ 60min，95℃ 5min；
（2）获得cDNA产物后进行miRNA定量检测，根据机型选择步骤A或B，配制PCR扩增反应体系；具体反应条件为95℃，15 min预变性；95℃，5s，58℃，30s，共30-40 个循环；
（3）扩增结果分析和数据处理：
绘制标准曲线，对待测标本的扩增结果进行分析处理并计算出相对含量。
权 利 要 求 书1/1页CN 108823304 A
一种辅助诊断高脂血症及动脉粥样硬化的试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种miR-125a-3p的逆转录引物，上游引物和辅助诊断高脂血症及动脉粥样硬化的试剂盒。
背景技术
[0002]心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，心血管疾病在我国已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，并且每年因患该病而导致残疾的人也在不断增多。动脉粥样硬化( atherosclerosis，AS) 是导致冠心病、脑卒中等多种疾病的主要病因，严重危害人类身体健康和生存质量，已成为心血管领域的关注热点。其主要病因是由于过多的脂质沉积在血管内壁，导致血管壁增厚，同时激活炎症反应，造成血管壁损伤，导致动脉粥样硬化。随着病情的加重，血管壁会进一步硬化，血液内过多的脂质会造成血管的阻塞，使血液不能正常通过而形成血栓，从而引发中风、心肌梗塞。心血管疾病发展到后期，由于心脏长期泵血不良，全身器官都可能淤血缺氧而遭到不同程度的损害，如出现肺部感染、肝硬化、高血压、肾衰等多种并发症，这些症状又反过来又会加重心血管疾病的病情，对身体造成更为严重的损害。
[0003]因miRNA稳定存在于人的体液及血液系统中，具有可重复性，能够从外周血中稳定检测，可以作为疾病的生物学标记。通过对心血管疾病患者和正常人的miRNA差异表达分析，可以鉴定得到相关的敏感miRNA，发现特异性表达的miRNA对于心血管疾病的诊断和具有非常重要的意义。SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光染料，利用荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点。通过查阅文献发现，当前国内外尚未有明确的针对高脂血症及动脉粥样硬化相关性疾病的辅助诊断的microRNA的SYBR Green Ⅰ
实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的建立可以填补该领域的空白。
[0004]MicroRNAs（简写为miRNAs, miRs）是一类长度为18～25个核苷酸单链的内源性非编码性小RNA，可以通过种子序列与靶mRNA 的5'-UTR和3'-UTRˊ区相互作用，抑制其转录或使其降解，降解或抑制靶基因，在转录或翻译水平调节基因或蛋白表达，参与多种生物学过程。人源miR-125a-3p（has-miR-125a-3p, MIMAT0004602）和鼠源 miR-125a-3p（mmu-miR-125a-3p, MIMAT0004528）成熟体均包含如下序列：
5’- ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC -3’(SEQ ID1)。
[0005]mmu-mir-125a（MI0000151）茎环结构序列为：
CUGGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACGUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGG (SEQ ID2)。
[0006]研究表明，miR-125b-3p表达可见于多种肿瘤组织。有研究报道，miR-125b-3p可以通过抑制雌激素受体的转录活性，从而诱导雌激素受体阳性乳腺癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。另有学者结合靶基因预测软件的分析结果，推测miR-125b-3p可能参与了胚胎心脏的异常发育过程。另外，研究显示，血浆外泌体miR-125b-2-3p可作为缺血性脑卒中的生物
标志物。
[0007]目前，关于miR-125a-3p可以辅助诊断高脂血症、动脉粥样硬化还未见报道。
发明内容
[0008]本发明的目的在于提供一种miRNA引物，用于miR-125b-3p特异性扩增，应用于高脂血症及动脉粥样硬化相关性疾病的辅助诊断。本发明人经前期研究，发现此引物序列可以用于辅助诊断高脂血症及动脉粥样硬化相关性疾病，前期实验取得了很好的技术效果，从而完成了本发明。
[0009]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所提供的一种m i R-125a-3p的逆转录引物序列为：5’- CUGGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACGUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGGGGCTCCCA -3’(SEQ ID3)。
[0010]所述miR-125a-3p为人源miR-125a-3p（has-miR-125a-3p, MIMAT0004602）或鼠源 miR-125a-3p（mmu-miR-125a-3p, MIMAT0004528）。
[0011]本发明提供的一种miR-125b-3p的特异性引物序列为：
上游引物序列：5’- ACAGGTGAGGTTCTTG-3’(SEQ ID4)
一种辅助诊断高血脂及动脉硬化的试剂盒，该试剂盒包括如下组分：
上述特异性10×miRNA逆转录引物、20×miRNA 上游引物、20×miRNA 通用引物、4×One step miRNA RT Solution、 5×SYBR Green qPCR Mix、50×ROX Reference Dye。[0012]所述miRNA 通用引物为5’- ACCTGTGAGGACGTCCAGG -3’(SEQ ID5)。
[0013]上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
（1）提取细胞中的RNA后，利用本试剂盒中的miRNA逆转录引物及逆转录试剂（4×One step miRNA RT Solution）进行逆转录，具体条件为37℃ 60min，95℃ 5min；
（2）获得cDNA产物后进行miRNA定量检测，根据机型选择步骤A或B，配制PCR扩增反应体系；具体反应条件为95℃，15 min预变性；95℃，5s，58℃，30s，共30-40 个循环；
（3）扩增结果分析和数据处理：
绘制标准曲线，对待测标本的扩增结果进行分析处理并计算出相对含量。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明根据NCBI网站及miRbase数据库，到miR-125a-3p成熟体基因序列，设计特异性引物，通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测miR-125a-3p基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。该方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可用于高脂血症及动脉粥样硬化相关性疾病患者的辅助诊断。利用本发明的试剂盒可对高脂血症及动脉粥样硬化相关性疾病患者的miR-125a-3p基因进行扩增，并进行定量分析。
附图说明
[0015]图1 为miR-125a-3p基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的熔解曲线。[0016]图2 为miR-125a-3p基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的扩增曲线。
[0017]图3.正常健康人与高脂血症、动脉粥样硬化患者外周血单核细胞内miR-125a-3p 表达。
[0018]图4.正常野生型WT小鼠与ApoE-/-小鼠主动脉血管及心脏中miR-125a-3p表达。
具体实施方式
[0019]实施例1 引物设计
利用N C B I网站及m i R ba s e数据库，到m i R-125a-3p成熟体基因序列，利用primer3input软件明确
miR-125a-3p的逆转录引物及模板序列，应用primer3plus软件对miR-125a-3p基因序列进行引物设计，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。[0020]设计的引物如下：
一种m i R-125a-3p的逆转录引物序列为：5’- CUGGGUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACGUCCAGGGUCACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCCUGGGGCTCCCA -3’(SEQ ID3)。
[0021]上游引物序列：5’- ACAGGTGAGGTTCTTG-3’(SEQ ID4)
本发明所公开的引物序列均能够以人工合成的方法或其它生物学方法获得。[0022]制备一种辅助诊断高血脂及动脉硬化的试剂盒，该试剂盒包括如下组分：上述特异性10×miRNA逆转录引物 100μl、20×miRNA 上游引物 100 μl、20×miRNA 通用引物 100 μl、4×One step miRNA RT Solution、 5×SYBR Green qPCR Mix 400μL、50×ROX Reference Dye 40μl。
[0023]（2）按照以下组分配制反转录反应液：
microRNA（0.01-0.1 μg）or Total RNA 0.1-2 μg
4×One step miRNA RT Solution 5 μl
*10×miRNA逆转录引物 2 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
（3）反转录反应条件:
37℃ 60min；95℃ 5min。
[0024]（4）获得cDNA产物后进行miRNA定量检测，根据机型选择步骤A或B，配制反应体系：A: 需要添加ROX染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT, 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems)；Mx3000P (Stratagene)等。
[0025]按照如下组分配制20 μl PCR反应体系：
5×SYBR Green qPCR Mix 4 μl
50×ROX Reference Dye 0.4 μl
PCR Forward Primer(20×) 1 μl
PCR Universal Primer(20×) 1 μl
cDNA模板 1～2.5 μl
ddH2O Up to 20 μl
B：无需添加ROX染料进行反应孔间信号矫正的Real- Time PCR仪，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene（Bioer，杭州博日）等。
[0026]按照如下组分配制20μl PCR反应体系：
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