[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101490260A [43]公开日2009年7月22日
[21]申请号200780026080.6[22]申请日2007.05.11
[21]申请号200780026080.6
[30]优先权
[32]2006.05.11 [33]EP [31]06009809.2
[86]国际申请PCT/EP2007/004192 2007.05.11
[87]国际公布WO2007/131720 EN 2007.11.22
[85]进入国家阶段日期2009.01.09[71]申请人科兹莫弗姆有限公司
地址荷兰代尔夫特
[72]发明人S·舍费尔 M·A·范登贝尔赫 D·博尔
格尔 T·许勒
[74]专利代理机构永新专利商标代理有限公司代理人林晓红[51]Int.CI.C12N 15/55 (2006.01)C12N 15/54 (2006.01)C12N 15/53 (2006.01)
C12N 9/80 (2006.01)
C12N 9/02 (2006.01)C12N 9/10 (2006.01)
权利要求书 4 页 说明书 134 页 附图 31 页
[54]发明名称
使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类
碱的生产
[57]摘要
本发明提供遗传工程化的微生物菌株，特别是
每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱或 其盐或酯。本发明提供获得遗传工程化的微生物菌
株的方法，所述菌株产生，以每克CDW计，至少0.5
mg的式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯。所述方法
和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，
所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异
性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，
和/或b)降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/
或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所
述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性
地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类
碱的神经酰胺，和分离具有所要求的生产力的菌株。
200780026080.6权 利 要 求 书第1/4页 1.一种微生物菌株，所述微生物菌株产生，以每克C D W计，至少0.5m g 的式I所示的鞘氨醇类碱：
或其盐或酯，其中R是X-(CH2)m-Y-(CH2)n-CH3，其中
a.X是CH2或CHOH，并且
c.Y是CH2-CH2，CH＝CH或CH＝CCH3，并且
d.n在4和14之间，优选地n是8或10。
2.获得权利要求1的微生物菌株的方法，所述方法通过如下步骤进行：
a.提高编码具有神经酰胺合酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，和/或
b.降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，和
c.分离具有权利要求1限定的生产力的菌株。
3.权利要求2的方法，进一步包括提高编码具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶的多核苷酸的表达。
4.权利要求2或3的方法，包括用一或多种权利要求2或3限定的编码所述酶的多核苷酸进行DNA介导的转化。
5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述具有神经酰胺合酶活性的酶选自：
a.具有S E Q I D N O：2和/或S E Q I D N O：4所示的氨基酸序列的多肽，
b.具有与S E Q I D N O：2所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性和/
或与S E Q I D N O：4所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽，
c.具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽，
d.具有与S E Q I D N O：9所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽，
e.具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的多肽，和
f.具有与S E Q I D N O：10所示的氨基酸序列有至少45％序列相同性的氨基酸序列的多肽。
6.权利要求2-4任一项的方法，其中所述酶具有神经酰胺酶活性，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，所述酶选自：
d.具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的多肽，和
e.具有与S E Q I D N O：15所示的氨基酸序列有至少70％序列相同性的氨基酸序列的多肽。
7.权利要求2-4任一项的方法，其中所述具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶选自：
f.具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽，和
g.具有与S E Q I D N O：6所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的氨基酸序列的多肽。
8.权利要求2-4任一项的方法，其中所述酶具有神经酰胺酶活性，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，所述酶选自：
h.具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽，和
i.具有与S E Q I D N O：8所示的氨基酸序列有至少25％序列相同性的氨基酸序列的多肽。
9.权利要求3或4的方法，其中所述具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶选自：
j.具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的多肽，和
k.具有与S E Q I D N O：17所示的氨基酸序列有至少30％序列相同性的氨基酸序列的多肽。
10.权利要求2-9任一项的方法，其中所述编码具有鞘脂Δ8去饱和
酶活性的酶或编码具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸得自真菌或酵母，优选地得自酿酒酵母(S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、Pichia ciferrii、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、白假丝酵母(Candida albicans)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或棉桃阿舒氏囊霉(Ashbyagossypii)，更优选地得自酵母Pichia ciferrii、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺。
11.权利要求2-9任一项的方法，其中所述编码具有神经酰胺合酶活性的酶或编码具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶的多核苷酸得自病毒、真菌、植物或动物，更优选地得自藻类病毒、酵母或哺乳动物，最优选地得自颗石藻类病毒属(Coccolithovirus)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(S c h i z o s a c c h a r o m y c e s)、德巴利酵母属(D e b a r y o m y c e s)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、阿舒氏囊霉属(Ashbya)、小鼠、大鼠或人类。
12.权利要求2-9任一项的方法，其中所述编码具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸得自动物，优选地得自哺乳动物，更优选地得自小鼠、大鼠或人类，所述神经酰胺酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺。
13.用于生产式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯的方法，包括在有益于产生所述鞘氨醇类碱的条件下对权利要求1的微生物菌株进行发酵，和从发酵液中收集所述鞘氨醇类碱。
14.显示神经酰胺合酶活性的多肽，其选自由具有S E Q I D N O：2所示的氨基酸序列的多肽、具有与S E Q I D N O：2所示的氨基酸序列有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽、具有S E Q I D N O：4所示的氨基酸序列的多肽和具有与S E Q I D N O：4所示的氨基酸序列有至少55％、优选地至少60％、更优选地至少70％、更优选地至少80％、最优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。
15.显示鞘脂Δ8去饱和酶活性的多肽，其选自由具有S E Q I D N O：6所示的氨基酸序列的多肽和具有与S E Q I D N O：6所示的氨基酸序列有至少65％、优选地至少70％、更优选地至少80％、最优选地至少90％序列相同
性的氨基酸序列的多肽组成的一组。
16.显示神经酰胺酶活性的多肽，所述神经酰胺酶优先或甚至特异性地水解具有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，所述多肽选自由具有S E Q I D N O：8所示的氨基酸序列的多肽和具有与S E Q I D N O：8所示的氨基酸序列有至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、最优选地至少90％序列相同性的氨基酸序列的多肽组成的一组。
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