[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1646681A [43]公开日2005年7月27日
[21]申请号03807936.4[22]申请日2003.04.08
[21]申请号03807936.4
[30]优先权
[32]2002.04.08 [33]GB [31]0208041.4
[32]2002.09.19 [33]US [31]60/411,751
[86]国际申请PCT/EP2003/003631 2003.04.08
[87]国际公布WO2003/064630 EN 2003.08.07
[85]进入国家阶段日期2004.10.08[71]申请人英国龙沙生物医药股份有限公司
地址英国伯克郡
[72]发明人D·梅沃林 J·韦特
[74]专利代理机构上海专利商标事务所有限公司代理人周承泽
[51]Int.CI 7C12N 5/02C07K 16/00
权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 10 页
[54]发明名称
[57]摘要
一种在醇酸(alcanoic acid)存在的情况下培
03807936.4权 利 要 求 书第1/2页 1.生产产物蛋白的方法，其中，所述蛋白质至少在细胞培养的某个时间段中由哺乳动物细胞，优选由淋巴细胞，在细胞培养物中表达，包含以下步骤： e)制备一种用于培养哺乳动物细胞的细胞培养基，优选制备一种无丁酸盐的细胞培养基，更优选制备一种允许哺乳动物细胞生长的细胞培养基，再优选一种无蛋白的细胞培养生长培养基， f)再加入乙酸、乙酸盐或乙酸酯，至终浓度为1-20mM，优选3-15mM，更优选5-12mM，最优选6-9.5mM，所述的添加可以在细胞培养之前直接加入到培养基中，或可以在细胞培养过程中将之补料到培养基中，
g)在所述培养基中进一步培养所述细胞，优选使所述细胞在所述培养基中生长，伴随着产物蛋白的表达，
h)最后从细胞培养物中收获所述蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，乙酸或其盐在起始细胞培养之前或起始细胞培养之时直接加入到培养基中。
3.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，碱金属乙酸盐或碱土金属乙酸盐被加入到培养基中。
4.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述细胞是淋巴细胞，优选NSO 细胞。
5.如权利要求4的方法，其特征在于，所述细胞是NSO细胞，其是重组细胞并能表达谷氨酰胺合成酶。
6.用于动物细胞培养的细胞培养基，其特征在于，所述培养基适合培养哺乳动物细胞，其包含乙酸、乙酸盐或生物学活化的乙酸酯，浓度为1-20mM，优选3-15mM，更优选5-12mM，最优选6-9.5mM，并且所述培养基优选不包含丁酸及其任何盐。
7.如权利要求3所述的细胞培养基，其特征在于，所述培养基是高密度细胞培养基。
8.如权利要求6或7所述的细胞培养基，其特征在于，所述培养基是允许动物细胞生长的细胞培养基，优选允许淋巴细胞生长的细胞培养基。
9.如权利要求6-8所述的细胞培养基，其特征在于，所述培养基是一种无血清的和无蛋白的细胞培养基，优选适合N S O细胞培养的无蛋白培养基。
03807936.4权 利 要 求 书 第2/2页
10.一种用于制备如权利要求6所述培养基的培养基浓缩物，其是固体的或液体的。
11.如权利要求6所述的细胞培养基用于淋巴细胞培养。
12.在权利要求6所述的细胞培养基中的细胞培养，包含哺乳动物细胞，优选淋巴细胞，更优选NSO细胞。
03807936.4说 明 书第1/11页
细胞培养基
细胞培养基
本发明主要涉及动物细胞培养领域。本发明设计了一种培养动物细胞的方法，用于生产性蛋白或其他用途的蛋白，本发明还设计了一种独特的细胞培养基。 已知丁酸钠或其他丁酸盐能够提高蛋白在动物细胞培养中的产量，比如在E P-239 292 A中所描述的。这种效果可以从天然分泌的蛋白中观察到，如从杂交瘤或重组细胞系中获得抗体。丁酸盐加入细胞培养基的浓度最好高至5m M。丁酸的效果是比较特殊的，这已经被许多关于将丁酸加入到培养基的科学文献所验证；相比而言丙酸盐或戊酸盐在浓度约1mM时相当的低效。
然而，使用丁酸盐作为细胞培养添加剂具有局限和缺点。以0.1-10m M的浓度范围添加丁酸盐时，需要仔细地称量，以免因剂量过高引起中毒以及抑制细胞生长。即使小量的浓度增加也可引起剧烈的生长速率负作用。对于每一种细胞系和重组克隆，必需仔细选择最佳量的丁酸盐，并且在大规模生物反应器培
养过程中进行调节控制。比如在E P-239292A中，对于杂交瘤细胞来说，从0.1-1m M的浓度范围是适宜的，而其他细胞系在丁酸盐浓度1m M以下时可具有好的耐药性。已知杂交瘤细胞对于反作用比其他细胞系更加敏感，所述反作用如氧气或营养供应不足，或化合物毒性影响；并且一旦接收到这种负面刺激因素，它们更易于且不可逆转地起始程序性细胞死亡。可见，在用于细胞培养提高产率时，丁酸盐具有一定的两面性作用。 Kim等(Biotechnology and Bioengineer 71，2001，184-193；bcl-2的超表达抑制C H O细胞中丁酸钠-诱导的凋亡，引起人源化抗体产量的提高)使用b c l-2重组细胞系计算了丁酸钠在5m M时的细胞毒性作用，其结果测量出提高的蛋白产物。然而，该方法需要大量的细胞系工程技术来构建重组体，包括重组体b c l-2和产物蛋白。因此一种更简单的用于计算丁酸盐培养基添加剂的负作用的方法将更加便利。 U S 5378 612描述了一种增效的提高蛋白产量的方法，在已经包含1m M丁酸钠的CHO细胞培养基中加入锂盐(10mM)或脂多糖(LPS，1μg/ml)。对于两种不同的锂盐，产量的影响为1.3倍，而L P S显示的产量提高约在丁酸盐对照的4倍。令人感兴趣的是，在该试验系统中，10m M的乙酸钠与对照相比完全没有有益作用。
03807936.4说 明 书 第2/11页 Kooistra等(Biochem.J.1987；在培养的人内皮细胞中丁酸盐刺激组织-型血纤维蛋白溶酶原-活化剂的合成，244：605-612)在包含血清的内皮细胞培养中，试验了不同化合物的潜在的对t P A产物的表达-提高作用，它们中间有一些醇酸(a l c a n o i c a c i d s)包括5m M的乙酸盐。具有这种效果的只有丙酸盐、戊酸盐、以及作用显著的丁酸盐，乙酸盐与对照相比没有太大的不同。
本发明的一个目的是避开现有技术的缺点，设计出另一种在动物细胞培养中提高产物蛋白产量的方法。
在本发明中，通过在细胞培养基中加入乙酸盐进行动物细胞培养的方法来实现此目的。本发明的另一个目的是提供与独立权利要求1、6、10、11和12相应的包含乙酸盐的细胞培养基。
本发明的可能的体现方式显示在如下的图示和表格中：
图1显示了在流加式摇瓶培养中，乙酸钾和乙酸钠对于N S O产率的影响。 图2显示了不包含或包含10m M乙酸钠的流加式生物反应器发酵的N S O生长图。 图3显示了在根据图2进行的发酵过程中，10m M乙酸钠对于N S O产率的影响。 图4对比了在接种体培养物(i n i n o c)中加入乙酸钠对N S O的影响以及进一步加入乙酸的时间选择(在接种时或在中期-指数期，即a t f e e d)。所有的值以与对照相比的百分数差异来表示。
图5和图6显示了在定制的高密度生长培养基中含有7.5m M乙酸时，重组N S O细胞的生长和抗体产率。
图7和图8显示了在NSO细胞培养中补加乙酸钠的剂量-反应曲线。
图9-11显示了在NSO细胞培养基中补加n-丁酸钠的比较数据。
图12-14显示了在V P M 8杂交瘤细胞培养中补加乙酸钠的剂量-反应曲线。 图15-17显示了在V P M 8
杂交瘤细胞培养中补加n-丁酸钠的比较数据。 在本发明中，设计了一种生产产物蛋白的方法，其中产物蛋白从一种存在于细胞培养基中的哺乳动物细胞中表达出来，并且至少在细胞培养过程中的某个时间段中被表达。也就是说，产物蛋白既可以是由细胞结构性表达的，也可以是在某些时间点上被某种细胞刺激物诱导表达的。优选的，产物蛋白是被结构性表达的。本发明的方法进一步包含以下步骤：
a)制备用于哺乳动物细胞的细胞培养基，
b)进一步加入乙酸、乙酸盐或生物学活化的乙酸酯，至终浓度为1-20m M，优选
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