(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010950403.8
(22)申请日 2020.09.11
(71)申请人 苏州一兮生物科技有限公司
地址 215228 江苏省苏州市吴江区盛泽镇
南三环路(溪南村)科创园企业孵化基
地204室
(72)发明人 刘振云 王旭 程丰伟 郭涛
倪磊
(74)专利代理机构 北京科家知识产权代理事务
所(普通合伙) 11427
代理人 宫建华
(51)Int.Cl.
C12N 15/63(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
C12N 15/113(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种双gRNA ‑pTargetF质粒的
构造方法，该双gRNA ‑pTargetF质粒的构造方法
基于G i bs o n A s s e m bl y 介导。进行G i bs o n Assembly时，连接三个片段，所连接的三个片段
每个片段使用了0.33pmol的量，共1pmol；之后的
50℃水浴时间选择了45min；本发明含有双gRNA
的pTargetF质粒能为之后的CRISPR ‑Cas9基因编 辑提高了效率，简化了实验操作。同时在设计长
引物时添加了一些酶切位点(列如Spe Ⅰ,Acc65
Ⅰ)，更加有利于基因编辑的酶切连接的实验设计
和操作。
权利要求书2页 说明书8页序列表2页 附图3页CN 112011562 A 2020.12.01
C N 112011562
A
1.一种双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，所述双gRNA-pTargetF质粒的构造方法基于Gibson Assembly介导。
2.根据权利要求1所述的双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，进行Gibson Assembly时，连接三个片段，所连接的三个片段每两个片段之间的重叠序列含有15-30个碱基，每个片段使用了0.33pmol的量，共1pmol；之后的50℃水浴时间选择了45min。
3.根据权利要求1所述的双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
步骤a.设计扩增gRNA和环p的引物，在环p的引物中添加了酶切位点Spe Ⅰ,Acc65 Ⅰ两侧的序列；
步骤b.设计四个长引物合成gRNA2目标片段；
步骤c.构建含双gRNA的pTargetF质粒：
利用Gibson Assembly技术，将上述步骤所获得的目标片段进行连接
Gibson Assembly体系
ddH2O加至20ml
水浴45min；
步骤d.步骤c连接产物进行转化进入DH5α中，挑取阳性克隆菌株并进行基因测序，最后提取目的质粒。
4.根据权利要求3所述的双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，所述步骤a使用：
gRNA1-F SEQ ID No.1；
gRNA1-R SEQ ID No.2；
环p-F SEQ ID No.3；
环p-R SEQ ID No.4；
以pTargetF质粒为模板，利用上述所设计的引物进行PCR扩增获得目标片段gRNA1,HP。
5.根据权利要求3所述的双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，所述步骤b使用：
L1-F SEQ ID No.5；
L2-R SEQ ID No.6；
L3-F SEQ ID No.7；
L4-R SEQ ID No.8；
四个长引物分别取2.5ug，配成50ml PCR反应体系直接变性，退火，延伸2-3个循环获得目标片段gRNA2。。
6.根据权利要求4所述的双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，所述步骤a中gRNA1片段PCR扩展条件为：
HP片段PCR扩展条件为：
7.根据权利要求5所述的双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，其特征在于，所述步骤b中片段gRNA2 PC
R扩展条件为：
DdH2O加至50ul。
一种双gRNA-pTargetF质粒的构造方法
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，特别涉及质粒构造方法。
背景技术
[0002] 1.Gibson Assembly
[0003]Gibson Assembly由Daniel Gibson博士及其同事在J.Craig Venter研究所，并由Synthetic Genomics，Inc.授权给NEB。允许成功组装多个DNA片段，而不管碎片-长度或端部兼容性。它已被合成迅速采用生物界，因为其易用性，灵活性和对大型DNA的适用性结构体。Gibson Assembly有效地将多个重叠的DNA片段连接到一个单管等温反应(1,2)。吉布森装配预混料包括在单个缓冲液中执行的三种不同的酶促活性：
[0004]核酸外切酶产生单链3′突出端，方便在一端(重叠区域)共享互补性的片段的退火。
[0005]专有的DNA聚合酶填补了每个退火片段的缺口。
[0006]DNA连接酶可在组装的DNA中密封切口。
[0007]最终结果是可以提供服务的双链全封闭DNA分子作为PCR，RCA或其他各种分子生物学应用的模板，包括直接转换。该方法已被Gib-成功使用儿子的小组和其他人组装寡核苷酸，DNA重叠重叠(15–80bp)，片段长数百千个碱基(1-2)。
[0008] 2.重叠引物的结构
[0009]用于Gibson Assembly的PCR引物必须具有两个序列成分：
[0010]组装相邻片段所需的重叠序列；
[0011]PCR期间模板引发所需的基因特异性序列放大；
[0012]非引物重叠序列添加在引物的5'末端。这个该序列与相邻片段的5′-末端序列同源。重叠序列的长度取决于序列的GC含量。引物的基因特异性序列在引物的3'末端添加重叠序列。
[0013] 3.gRNA
[0014]向导RNA(guide RNA，gRNA)，也称为小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)。是作用于动质体(kinetoplastid)体内一种称为RNA编辑(RNA editing)的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。可与pre-mRNA配对，并在其中插入一些尿嘧啶(U)，产生具有作用的mRNA。向导RNA编辑的RNA分子，长度大约是60～80个核苷酸，是由单独的基因转录的，具有3'寡聚U的尾巴，中间有一段与被编辑mRNA精确互补的序列，5'端是一个锚定序列，它同非编辑的mRNA序列互补。
[0015]CRISPR-Cas系统(The clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats-associated prot
ein systems)是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcription activator-like effector
nucleases,TALEN)相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。
[0016]大肠杆菌质粒长期以来是研究者和行业使用的重组DNA分子的主要来源。现今，随着下一代生物技术产品(例如，基因药物和DNA疫苗)进入临床试验并最终进入制药市场，质粒DNA变得越来越重要。含双gRNA的质粒DNA可用作媒介物通过CRISPR-Cas系统以将目的基因转入细菌基因组中。
[0017]CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点。
[0018]在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA(Trans-activating crRNA,tracrRNA)退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配
对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5『-NGG-3』)为Cas9识别位点，是实现剪切功能的关键。
[0019]目前的方法缺陷如下：
[0020]含有单gRNA的质粒进行的基因敲除等实验操作步骤复杂，困难，成功率较低在CRISPR系统中，含有的单sgRNA进行切割时，通常离切割位点越远，效率越低。含双sgRNA的序列可以在断裂切割位点更有效实现剪切功能，形成双链断裂，分别靶向DNA互补的两条链，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除。
发明内容
[0021]为了解决上述存在的问题，本发明能够更加有效的构建含多个gRNA的质粒载体，在分子生物学领域CRISPR-Cas9基因编辑方面能更加有效的进行基因敲除等实验。[0022]本发明提供了一种双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，该双gRNA-pTargetF质粒的构造方法基于Gibson Assembly介导。
[0023]进一步的本发明提供了一种双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，进行Gibson Assembly时，连接三个片段，所连接的三个片段每两个片段之间的重叠序列含有15-30个碱基，每个片段使用了0.33pmol的量，共1pmol；之后的50℃水浴时间选择了45min。
[0024]本发明提供了一种双gRNA-pTargetF质粒的构造方法，该方法包含如下步骤：[0025]步骤a.设计扩
增gRNA和环p的引物，在环p的引物中添加了酶切位点SpeI,Acc65I 两侧的序列；
[0026]步骤b.设计四个长引物合成gRNA2目标片段；
[0027]步骤c.构建含双gRNA的pTargetF质粒：
[0028]利用Gibson Assembly技术，将上述步骤所获得的目标片段进行连接
[0029]Gibson Assembly体系
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