(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011470596.3
(22)申请日 2020.12.14
(71)申请人 河南科技大学第一附属医院
地址 471000 河南省洛阳市涧西区景华路
24号
(72)发明人 高社干 谷变利 兰子君 刘轲
(74)专利代理机构 河南省古格知识产权代理事
务所(普通合伙) 41197
代理人 陈娟
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/02(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
备方法和应用
(57)摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种原代
分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和
应用。其中，原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，
按重量组分计，包括：混合蛋白胨10‑20份、酵母
浸出粉5‑10份、氯化钠1‑5份、琼脂10‑15份、葡萄
糖0.5‑1.0份、碳酸氢钠0.2‑0.8份、L ‑半胱氨酸
盐0.1‑0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1‑0.5份、血红
素0.0001‑0.0005份、维生素K 0.00001‑0.00005
份、水500‑1000份和无菌脱纤维绵羊血5‑10份。
通过采用本发明实施例提供的原代分离牙龈卟
啉单胞菌的培养基，大大缩短原代分离牙龈卟啉
单胞菌的培养周期，能快速原代分离牙龈卟啉单
胞菌。权利要求书2页 说明书6页 附图7页CN 112501070 A 2021.03.16
C N 112501070
A
1.一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，其特征在于，按重量组分计，包括：
混合蛋白胨10‑20份、酵母浸出粉5‑10份、氯化钠1‑5份、琼脂10‑15份、葡萄糖0.5‑1.0份、碳酸氢钠0.2‑0.8份、L ‑半胱氨酸盐0.1‑0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1‑0.5份、血红素0.0001‑0.0005份、维生素K 0.00001‑0.00005份、水500‑1000份和无菌脱纤维绵羊血5‑10份。
2.根据权利要求1所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，其特征在于，包括：
混合蛋白胨15份、酵母浸出粉6份、氯化钠2.5份、琼脂15份、葡萄糖1.0份、碳酸氢钠0.4份、L ‑半胱氨酸盐0.5份、可溶性焦磷酸钠0.25g、血红素0.0005份、维生素K 0.00005份、水1000份和无菌脱纤维绵羊血10份；或者，
混合蛋白胨10份、酵母浸出粉5份、氯化钠2份、琼脂10份、葡萄糖0.5份、碳酸氢钠0.3份、L ‑半胱氨酸盐0.4份、可溶性焦磷酸钠0.15g、血红素0.0004份、维生素K 0.00004份、水700份和无菌脱纤维绵羊血7份。
3.一种如权利要求1或2所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L ‑半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，混匀，获得混合物溶液；
将混合物溶液高压灭菌，然后冷却处理；
按比例加入血红素储存液、维生素储存液和无菌脱纤维绵羊血至冷却后的混合物溶液中，混匀，获得液态培养基；
将液态培养基倒平板，冷却，获得固态培养基。
4.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述混合物溶液高压灭菌的温度为120～125℃，时间为10～20分钟；
所述混合物溶液的冷却处理步骤包括：高压灭菌完成后，待温度降至65～75℃时，置于60℃水浴锅中。
5.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，加入所述血红素储存液之前，还包括血红素储存液的制备步骤，具体步骤如下：
按比例将血红素和K 2HPO 4加入到去离子水中，混匀，煮沸灭菌，获得血红素储存液。
6.根据权利要求5所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，按重量组分计，所述血红素为0.5份，所述K 2HPO 4为1.74份，所述去离子水为100份。
7.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，加入所述维生素K储存液之前，还包括维生素K储存液的制备步骤，具体步骤如下：
按比例将维生素K和无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液。
8.根据权利要求7所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，按重量组分计，所述维生素K为0.5份，所述无水乙醇为100份。
9.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，加入所述无菌脱纤维绵羊血之前，需将所述无菌脱纤维绵羊血放入40～45℃水浴锅中预热。
10.权利要求1或2所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用，其特征在于：
将如权利要求1或2所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放置于37℃培养箱中，厌
氧条件下过夜；
取样，采用分区连续划线法，将样本接种至所述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上；
将接种后的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放于37℃培养箱中，厌氧条件下培养7天；
观察平板上的菌落形态，挑取黑圆形的单克隆至TSB液体培养基中，进行PCR鉴定；
对鉴定为牙龈卟啉单胞菌阳性的菌液，继续采用分区连续划线法，接种至另一个原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上，厌氧条件下培养直至平板上长出单一的牙龈卟啉单胞菌克隆；
其中，厌氧条件为：90％N
2，5％CO
2
，5％H
2
；TSB液体培养基由重量组分为30份的TSB和5
份的酵母提取物加入到1L的无菌水配制而成。
原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]牙周炎是一种常见的口腔慢性炎症性疾病，多发于35岁以上人。由牙龈及牙周支持组织上的微生物感染引起。其中，“红复合体”是导致牙周炎的重要因素。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是一类革兰氏阴性厌氧细菌，Pg在人体口腔、消化系统、心血管、大脑等部位均有分布。据研究报道，Pg作为“红复合体”的“基石”细菌之一，可通过多种途径与宿主细胞相互作用引发病变部位炎症，与口腔炎症、口腔颌面部肿瘤、消化道肿瘤、阿尔兹海默症及其他系统性疾病相关。口腔是Pg最主要的栖居地，在牙周袋、龈沟、齿间、舌面、牙龈等部位均可检测到Pg。体外培养是研究Pg致病性及牙周炎、消化道肿瘤等相关疾病的重要方法。
[0003]已有技术中，牙周炎致病厌氧菌的培养基多采用TSB agar、Schaedler's agar等培养基，这些培养基营养成分丰富，可以培养的细菌较为广谱，不仅能有效培养Pg，还可以培养其他非目标杂菌，对Pg
的原代分离产生很大阻碍；并且，因这些培养基还为其他非目标细菌提供丰富的营养，不能很好的满足Pg所需的全部要求；再者，Pg通常需要在厌氧条件下培养5‑7天，才会形成特征性的黑克隆，而长时间的培养，也有助于其他非目标杂菌的生长，从而为原代分离Pg带来了更大的困难，需要更长的筛选周期才能实现对Pg的分离。[0004]因此，需要提供一种能够从诸多细菌中快速原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基。
发明内容
[0005]本发明的目的之一在于提供一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，以解决现有技术中原代分离牙龈卟啉单胞菌难度大、时间长等问题。
[0006]本发明的目的之二在于提供一种上述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法。
[0007]本发明的目的之三在于提供一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用。
[0008]本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，按重量组分计，包括混合蛋白胨10‑20份、酵母浸出粉5‑10份、氯化钠1‑5份、琼脂10‑15份、葡萄糖0.5‑1.0份、碳酸氢钠0.2‑0.8份、L‑半胱氨酸盐0.1‑0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1‑0.5份、血红素0.0001‑0.0005份、维生素K0.00001‑0.00005份、水500‑1000份和无菌脱纤维绵羊血5‑10份。
[0009]优选地，包括混合蛋白胨15份、酵母浸出粉6份、氯化钠2.5份、琼脂15份、葡萄糖1.0份、碳酸氢钠0.4份、L‑半胱氨酸盐0.5份、可溶性焦磷酸钠0.25g、血红素0.0005份、维生素K 0.00005份、水1000份和无菌脱纤维绵羊血10份；或者，
[0010]混合蛋白胨10份、酵母浸出粉5份、氯化钠2份、琼脂10份、葡萄糖0.5份、碳酸氢钠0.3份、L ‑半胱氨酸盐0.4份、可溶性焦磷酸钠0.15g、血红素0.0004份、维生素K 0.00004份、水700份和无菌脱纤维绵羊血7份。
[0011]本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，包括如下步骤：
[0012]按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L ‑半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，混匀，获得混合物溶液；
[0013]将混合物溶液高压灭菌，然后冷却处理；
[0014]按比例加入血红素储存液、维生素储存液和无菌脱纤维绵羊血至冷却后的混合物溶液中，混匀，获得液态培养基；
[0015]将液态培养基倒平板，冷却，获得固态培养基。
[0016]进一步地，所述混合物溶液高压灭菌的温度为120～125℃，时间为10～20分钟；
[0017]所述混合物溶液的冷却处理步骤包括：高压灭菌完成后，待温度降至65～75℃时，置于60℃水浴锅中。
[0018]进一步地，加入所述血红素储存液之前，还包括血红素储存液的制备步骤，具体步骤如下：
[0019]按比例将血红素和K 2HPO 4
加入到去离子水中，混匀，煮沸灭菌，获得血红素储存液。[0020]进一步地，按重量组分计，所述血红素为0.5份，所述K 2HPO 4为1.74份，所述去离子水为100份。
[0021]进一步地，加入所述维生素K储存液之前，还包括维生素K储存液的制备步骤，具体步骤如下：
[0022]按比例将维生素K和无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液。
[0023]进一步地，按重量组分计，所述维生素K为0.5份，所述无水乙醇为100份。
[0024]进一步地，加入所述无菌脱纤维绵羊血之前，需将所述无菌脱纤维绵羊血放入40～45℃水浴锅中预热。
[0025]本发明的目的之三采用如下技术方案实现：一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用：
[0026]将上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放置于37℃培养箱中，厌氧条件下过夜；
[0027]取样，采用分区连续划线法，将样本接种至所述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上；
[0028]将接种后的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放于37℃培养箱中，厌氧条件下培养7天；
[0029]观察平板上的菌落形态，挑取黑圆形的单克隆至TSB液体培养基中，进行PCR鉴定；
[0030]对鉴定为牙龈卟啉单胞菌阳性的菌液，继续采用分区连续划线法，接种至另一个原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上，厌氧条件下培养直至平板上长出单一的牙龈卟啉单胞菌克隆；
[0031]其中，厌氧条件为：90％N 2，5％CO 2，5％H 2；TSB液体培养基由重量组分为30份的TSB
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