(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010648528.5
(22)申请日 2020.07.07
(30)优先权数据
62/921,826 2019.07.10 US
(71)申请人 香港科技大学
地址 中国香港九龙清水湾
(72)发明人 唐本忠 周成成 江美娟
(74)专利代理机构 深圳市顺天达专利商标代理
有限公司 44217
代理人 郭伟刚
(51)Int.Cl.
C07D 405/10(2006.01)
C09K 11/06(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种微环境敏感的聚集诱导
发光材料，用于在肉眼和细胞水平上快速可视化
区分鉴定革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真
构，呈现扭曲分子内电荷转移和AIE性质，从而对
病原体的微环境具有高度敏感的荧光颜响应
性。基于病原体自身结构和组成差异，具有阳离
子和膜活性香豆素基团的IQ ‑Cm选择性地作用于
三类微生物的不同位点，给出三种肉眼可辨别的
发光颜。同时，基于其不同的荧光颜响应，在
荧光显微镜下IQ ‑Cm可以直接在细胞水平上区分
三类微生物。此外进一步证实IQ ‑Cm作为可视化
探针可用于快速诊断尿路感染、及时监测医院获
得性感染过程以及霉菌的快速检测。权利要求书1页 说明书11页 附图12页CN 112209918 A 2021.01.12
C N 112209918
A
1.一种微环境敏感的AIE荧光探针，其特征在于，
包括以下结构：
其中，抗衡阴离子X -选自具有一个或多个电荷的阴离子；其中，每个R、R ’和R ”独立选自氢、羟烷基、氨基、烷氨基、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的AIE荧光探针，其特征在于，
所述AIE荧光探针具有以下结构：
3.根据权利要求1-2所述的AIE荧光探针用于区分病原菌的应用。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病原菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过所述病原菌与所述AIE荧光探针结合后导致所述AIE荧光探针的荧光发射强度和发射波长的差异实现对所述革兰氏阴性菌、所述革兰氏阳性菌和所述真菌的肉眼可视化鉴定，其中，所述革兰氏阴性菌为弱的肉粉发光，所述革兰氏阳性菌为橙红发光，所述真菌为强的黄发光。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述AIE荧光探针在细胞水平对所述革兰氏阴性菌、所述革兰氏阳性菌和所述真菌进行可视化区分鉴定。
7.根据权利要求1-2所述的AIE荧光探针用于对细菌和真菌染的应用。
8.根据权利要求1-2所述的AIE荧光探针用于尿路感染的可视化鉴定的应用。
9.根据权利要求1-2所述的AIE荧光探针用于霉菌的可视化检测的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 112209918 A
一种微环境敏感的AIE荧光探针及应用
技术领域
[0001]本发明涉及用于在肉眼和细胞水平上快速检测和鉴定革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌的聚集诱导发光材料。
背景技术
[0002]致病细菌和真菌无处不在，对人类健康和安全构成严重威胁。它们的感染已导致许多严重疾病，
例如尿路感染(UTI)、败血症和肺炎。通常，大肠杆菌等革兰氏阴性(G-)细菌对氟喹诺酮类、大环内酯类抗生物敏感，金黄葡萄球菌等革兰氏阳性(G+)细菌对青霉素类抗生素敏感，白念珠菌等真菌对唑类药物敏感。因此，病原菌类型的快速鉴定是减少抗生素滥用并确保有效的第一步。目前平板培养法作为诊断病原菌的金标准，通常耗时几天，可能会延误。革兰氏染法通过直接观察病原菌染后的颜，可以克服平板法耗时长的缺点，但由于其操作步骤繁杂、比法灵敏度低，且与检验医师的经验有关，导致其准确率较低(约40–60％)。此外，由于G+细菌和真菌在染后均呈现出蓝/紫，因此不能有效地区分G+细菌和真菌。缺乏及时可靠的病原菌信息，就会导致亚处方的使用。例如，在临床上，通常对尿路感染患者采用经验性或广谱抗生素。这不仅会导致效果不佳，增大医院获得性感染发生的几率，而且也大大促进了耐药性病原菌出现。因此，就需要开发一种简单可靠的方法来快速识别三类病原菌，以此指导抗菌药物的选择。特别是能直接实现对三类病原菌的肉眼可视化识别将对即时检验水平的快速诊断非常有利。[0003]荧光技术是一种快速、可视化鉴定病原菌的理想工具，其检测灵敏度比比法高一千倍以上。此外，G-细菌、G+细菌和真菌具有不同的表面结构和化学成分，为荧光探针可视化区分该三类菌提供了基础。G+菌和真菌具有被疏松多孔细胞壁覆盖的细胞质膜。相比之下，G-细菌具有额外的外膜，其发挥屏障功能。同时，不同于细菌，真菌是真核生物，其细胞细胞质中含有多种细胞器。三类病原菌表面结构和化学成分的不同决定荧光探针的作用微环境。许多具有推拉电子结构的荧光团具有微环境敏感性，并根据扭曲分子内电荷转移(TICT)效应，响应于微环境变化发射不同颜的荧光。然而，传统的荧光探针由于具有刚性平面结构，通常具有强的荧光背景，差的光稳定性
和聚集诱导猝灭(ACQ)效应，极大降低了其在灵敏度方面的优势。因此，利用传统荧光探针很难基于三类病原菌间的细微差异实现对它们的可视化区分鉴定。
[0004]不同于传统荧光分子，具有聚集诱导发光(aggregation induced emission，AIE)特性的荧光分子，由于具有多转子结构，通常在溶液中不发光或弱发光，但当其分子内运动受到周围环境限制时，发出强烈荧光。迄今为止，由于荧光背景低、光稳定性好等优点，AIE 分子在生物分析物传感方面已取得了巨大的成功。此外，AIE分子的多转子结构也赋予其对周围微环境高度敏感性，特别是在具有扭曲的推拉电子结构时，可以采取不同的分子构型，并基于TICT效应响应微环境变化给出多种荧光颜响应。同时，AIE特性可以通过抑制TICT 态的非辐射衰减来保证荧光响应颜的可视化。因此，合理地对AIE和TICT效应进行整合，设计合成同时具有两种特性的荧光探针，对于实现三类病原菌的快速、可视化鉴别诊断方
面具有广阔的应用前景。
[0005]在此发明中，开发了一种新型的具有扭曲和供体-π-受体(D-π-A)结构的阳离子AIE分子，名为IQ-Cm，用于区分鉴定三类病原菌。结构上，IQ-Cm由三部分组成：二苯基异喹啉(IQ)基团，香豆素衍生基团(Cm)和苯基连接基元。IQ部分具有高度扭曲的分子结构，呈现AIE活性，其固有的阳离子结构使其也充当强电子受体和病原菌负电表面靶向基团的角。由于许多香豆素衍生物具有膜活性，因此引入了香
豆素促进IQ-Cm与病原菌细胞膜间的相互作用。二乙氨基基团连接在香豆素上，作为强电子供体。进一步使用可旋转苯基作为IQ和Cm之间的连接基团，得到长的扭曲D-π-A结构，使IQ-Cm具有显著的AIE和TICT特性。基于三种病原菌外表面结构和细胞质成分的内在差异，IQ-Cm选择地作用于三类病原菌的不同位点，响应周围不同的微环境，从而在细胞水平上成功地将病原体信息转化为特征的荧光颜，实现基于肉眼可视化区分鉴定。此外，也证明了IQ-Cm在快速病原体诊断中的潜力，例如快速尿路感染诊断，对医院获得性感染的可视化监测以及霉菌的肉眼可视化检测。
发明内容
[0006]本发明主要关于一个具有扭曲D-π-A结构的简单AIE分子，可作为微环境敏感探针，通过给出三种可辨别的荧光发射颜快速鉴别G-细菌、G+细菌和真菌。IQ-Cm选择性作用于三类病原菌的不同部位(即G-细菌的细胞被膜和细胞质、G+细菌的细胞质和真菌的线粒体)，在三种情况下，IQ-Cm感受不同的微环境，基于其AIE和TICT效应，能有效地将病原菌信息转换为特征荧光发射颜。肉眼水平上，G-细菌为弱的肉粉发光，G+细菌为橙红发光，真菌为强的黄发光，可以直接快速地进行区分鉴定。当借助荧光显微镜，基于三种病原菌的特征荧光响应，可以实现在细胞水平上对三种病原菌的可视化鉴定。进一步地，IQ-Cm具有快速诊断尿路感染的潜力，通过直接肉眼可视化鉴定可以将诊断时间减少到几小时，当借助荧光显微镜可以将诊断时间减少到不到30分钟。另外，基于IQ-Cm对细菌和真菌的不同荧光颜响应，通过IQ-Cm可以及时可视化监测从初始细菌感染到真菌感染的医院获得性感染过程。这
对于指导临床用药至关重要。此外，由于真菌的强黄发光，IQ-Cm可用于快速检测食品领域中的霉菌。总之，本发明提供了一种即时简便的病原菌诊断平台，具有很高的应用潜力，可以为临床决策，监测传染病趋势和监督食品安全提供及时可靠的病原菌信息。
[0007]在本发明一实施例中，本发明是针对包含选自以下化学结构的荧光探针：
[0008]
[0009]其中抗衡阴离子X-选自具有一个或多个电荷的阴离子；
[0010]其中每个R、R’和R”独立选自氢、羟烷基、氨基、烷氨基、烷基，不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基。
[0011]在本发明一实施例中，提供如上所述的AIE荧光探针用于区分病原菌的应用。
[0012]在本发明一实施例中，所述病原菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。[0013]在本发明一实施例中，通过所述病原菌与所述AIE荧光探针结合后导致所述AIE荧光探针的荧光发射强度和发射波长的差异实现对所述革兰氏阴性菌、所述革兰氏阳性菌和所述真菌的肉眼可视化鉴定，其中，所述革兰氏阴性菌为弱的肉粉发光，所述革兰氏阳性菌为橙红发光，所述真菌为强的黄发光。
[0014]在本发明一实施例中，所述AIE荧光探针在细胞水平对所述革兰氏阴性菌、所述革兰氏阳性菌和所述真菌进行可视化区分鉴定。
[0015]在本发明一实施例中，提供如上所述的AIE荧光探针用于对细菌和真菌染的应用。
[0016]在本发明一实施例中，提供如上所述的AIE荧光探针用于尿路感染的可视化鉴定的应用。
[0017]在本发明一实施例中，提供如上所述的AIE荧光探针用于霉菌的可视化检测的应用。
附图说明
[0018]图1示出了AIE分子IQ-Cm的合成路线。
[0019]图2示出了(a)IQ-C单晶结构；(b)IQ-Cm晶体结构中的分子间相互作用。[0020]图3示出了(a)Q-Cm晶体的前沿分子轨道(HOMO和LUMO)；(b)IQ-Cm(10μM)在二恶烷(Diox)、THF、DMSO和水(1％DMSO)中的归一化荧光光谱，激发波长：430nm；(c)在不同水含量的DMSO/H2O混合物中IQ-Cm(20μM)的荧光光谱；激发波长：450nm；(内插图：最大荧光发射波长与DMSO/H2O混合物中水含量的关系图)；(d)在501或643nm处相对荧光强度(I/I0)与DMSO/ H2O混合物中水含量的关系图；其中501nm和643nm处的I0分别表示水含量(fw)为98％和0％时的荧光强度。
[0021]图4示出了IQ-Cm(10μM)在不同溶剂(二恶烷、THF、DMSO和含1％DMSO的水)中的归一化吸收光谱。
[0022]图5示出了(a)IQ-Cm的散射强度随DMSO/H2O混合物中水含量的变化图；(b)尺寸分布；(c)TEM图和(d)含98％水的DMSO/H2O混合物中IQ-Cm透射电子衍射图；IQ-Cm浓度：20μM。[0023]图6示出了IQ-Cm的光稳定性：(a)持续激光照射下，分别用IQ-Cm和PI染的死大肠杆菌(经75％酒精处理)的荧光信号变化以及相应的用IQ-Cm(上图)和PI(下图)染的在进行60次激光照射前后CLSM图像；IQ-Cm和PI的浓度：10μM；成像条件：激发波长：488nm(激光强度为0.5％)，收集发射波长范围：IQ-Cm为500-700nm，PI为600-700nm；(b)分别用IQ-Cm 和商用线粒体探针Mitotracker Green染的白念珠菌的荧光信号变化以及相应的进行60次激光照射前后CLSM图像；IQ-Cm和Mito-tracker Green的浓度：1.0M；成像条件：激发波长：488nm(激光强度为0.8％)，收集发射范围：500-700nm。
[0024]图7示出了(a)在PBS溶液中，IQ-Cm的荧光强度与浓度的关系图；(b)浓度为10μM的IQ-Cm的尺寸分布和(c)低温TEM图。
[0025]图8示出了(a)在365nm紫外灯照射下，加入不同病原菌前后的IQ-Cm荧光照片([大肠杆菌]＝108CFU/mL，[金黄葡萄球菌]＝108CFU/mL，[白念珠菌]＝107CFU/mL)；(b)三种病原菌自身以及加入病原菌前后IQ-Cm(10μM)荧光光谱，激发光波长：450nm；(c)在365nm
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