(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110000878.5
(22)申请日 2021.01.04
(71)申请人 郑州大学
地址 450000 河南省郑州市高新区科学大
道100号
(72)发明人 徐如强 彭颂 郭艳辉 刘金蕊
李盼宇 贾文静 赵俊恒
(74)专利代理机构 郑州异开专利事务所(普通
合伙) 41114
代理人 王霞
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
C12N 15/60(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 5/10(2018.01)
A01H 6/20(2018.01)
(54)发明名称提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP 含量的方法(57)摘要本发明公开了一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，首先利用生物信息资源，选定能够编码腺苷酸环化酶催化活性中心的模板DNA序列，然后采用PCR扩增或化学合成或其它可选择的克隆方法得到带有该序列片段的DNA产物，并且使其能够在转录表达后翻译生成具有腺苷酸环化酶催化活性的肽链或蛋白质；将获得的DNA产物利用DNA克隆技术，导入到所选的植物基因表达载体系统中，将其插入到控制外源基因表达的启动子和终止子元件序列之间的多克隆位点；将构建的植物基因表达载体进行遗传转化，获得腺 苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物。本发明方法为人们在植物中开发利用cAMP提供了新的思路，填补了对该
项研究的空白。权利要求书1页 说明书9页 附图3页CN 112442511 A 2021.03.05
C N 112442511
A
1.一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：包括下述步骤：
第一步，利用生物信息资源，选定能够编码腺苷酸环化酶催化活性中心的模板DNA序列，然后采用PCR扩增或化学合成的方法得到带有该序列片段的DNA产物，所述DNA产物能够在转录表达后翻译生成具有腺苷酸环化酶催化活性的肽链或蛋白质；
第二步，将第一步获得的DNA产物利用DNA克隆技术，导入到所选的植物基因表达载体系统中，将其插入到控制外源基因表达的启动子和终止子元件序列之间的多克隆位点；
第三步，将上述所构建的植物基因表达载体进行遗传转化，获得腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：第二步中所述的启动子是指以组成型或者诱导型方式控制基因转录起始的调控元件序列，终止子是指控制基因转录终止或者poly(A)形成的调控元件序列，从而形成一个完整的基因表达单元或者基因表达盒，使其能够在植物基因组中进行转录表达与蛋白质翻译。
3.根据权利要求1所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：将第三步得到的转基因植物提取总RNA，并通过反转录合成cDNA模板，然后利用定量PCR检测腺苷酸环化酶活性转基因的表达水平。
4.根据权利要求1所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，其特征在于：采集第三步得到的转基因植物组织样品，在液氮中研磨成粉末，加入高氯酸溶液进行提取，随后低温离心，收集上清提取液，冷冻干燥成粉末，利用cAMP酶联免疫法检测试剂盒测定样品中的cAMP含量。
权 利 要 求 书1/1页CN 112442511 A
提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术，尤其是涉及一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP 含量的方法。
背景技术
[0002]环腺苷酸（3',5'-cyclic adenosine monophosphate；cycilc AMP；cAMP）的发现与研究已有60多年的历史。它是在生物界普遍存在的一种第二信使分子，能够在生命活动中发挥重要的调节作用，对基因表达、细胞周期、免疫反应、新陈代谢、认知与记忆、环境适应性和生长发育等许多生物学过程产生显著影响。目前，人们对cAMP在细菌、真菌和动物等物种中的信号调节作用及其机制已具有相当的认识和了解，正在日益重视探索它在人类健康与卫生、疾病和药物研发中的应用价值。
[0003]植物组织细胞中cAMP的含量普遍较低，甚至达不到实验室常规技术的检测水平，导致人们迄今对植物中cAMP信号调节作用的了解明显落后于其它物种（徐如强等，2020；Blanco et al. 2020），从而也极大地限制了人们在植物中开发利用cAMP的前景。cAMP是由腺苷酸环化酶(ad enylyl cy cla se)直接催化三磷酸腺苷(ATP；ad enosine 5′-triphosphate)生成的产物, 这也是生物界合成cAMP的唯一生化反应途径；但是，cAMP也能够被磷酸二酯酶(phosphodiesterase)水解成单磷酸腺苷(AMP；adenosine 5′-monophosphate)。因此，细胞中cAMP的含量或水平取决于腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的活性反应之间所建立起的动态平衡结果。尽管如此，细胞内cAMP的信号调节作用主要依赖于激活腺苷酸环化酶的活性和cAMP浓度水平的提高。不同物种编码的腺苷酸环化酶在蛋白质结构上均包含非常保守的环化酶同源结构域(cyclase homology domain)，并形成具有明显特征的催化活性中心，从而决定了腺苷酸环化酶的活性。与其它物种不同，人们迄今在植物基因组中并未发现编码腺苷酸环化酶的专一功能基因，而是
发现一些植物基因编码的蛋白质结构中既包含腺苷酸环化酶的催化活性中心序列，又具有其它明显不同功能的保守结构域。例如，拟南芥编码的钾离子转运蛋白AtKUP5和AtKUP7主要发挥钾离子的吸收和转运功能，它们却包含腺苷酸环化酶催化活性中心的保守序列，并具有催化生成cAMP的腺苷酸环化酶活性（Al-Younis et al. 2015，2018）。很显然，自然界中植物的腺苷酸环化酶活性被整合在了一个具有其它明显不同功能的基因中，这可能是造成植物组织细胞中cAMP含量较低的重要原因之一，它也对解析植物中cAMP的信号调节作用及其开发利用带来不可避免的局限性。解决这些问题的根本途径是开发和利用具有编码腺苷酸环化酶活性专一功能基因的植物模型，提高植物中腺苷酸环化酶活性的表达水平与cAMP含量。很遗憾，迄今在这方面的研究报道仍属空白。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供一种提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的提高植物中腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量的方法，包括下述步骤：第一步，利用生物信息资源，选定能够编码腺苷酸环化酶催化活性中心的模板DNA序列，然后采用PCR扩增或化学合成方法（或其它的克隆方法）得到带有该序列片段的DNA产物，所述DNA产物能够在转录表达后翻译生成具有腺苷酸环化酶催化活性的肽链或蛋白质；
第二步，将第一步获得的DNA产物利用DNA克隆技术，导入到所选的植物基因表达载体系统中，将其插入到控制外源基因表达的启动子和终止子元件序列之间的多克隆位点；所述的启动子是指以组成型或者诱导型方式控制基因转录起始的调控元件序列，终止子是指控制基因转录终止或者poly(A)形成的调控元件序列，从而形成一个完整的基因表达单元或者基因表达盒，使其能够在植物基因组中进行转录表达与蛋白质翻译；
第三步，将上述所构建的植物基因表达载体进行遗传转化，获得腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物。
[0006]将第三步得到的转基因植物提取总RNA，并通过反转录合成cDNA模板，然后利用定量PCR检测腺苷酸环化酶活性转基因的表达水平。
[0007]采集第三步得到的转基因植物组织样品，在液氮中研磨成粉末，加入高氯酸溶液进行提取，随后低温离心，收集上清提取液，冷冻干燥成粉末，利用cAMP酶联免疫法检测试剂盒测定样品中的cAMP含量。
[0008]本发明利用编码腺苷酸环化酶催化活性中心保守序列的核苷酸片段，尤其是植物来源的这种核苷酸片段，通过DNA重组技术构建表达腺苷酸环化酶活性的人工合成基因，并通过转基因技术手段将其导入植物基因组内表达，获得能够使腺苷酸环化酶表达活性与cAMP含量显著提高的转基因植物，为人们
在植物中开发利用cAMP提供了新的思路，填补了对该项研究的空白。
附图说明
[0009]图1 是所构建的表达载体pMDC83-AC和诱导性表达载体pTA7001-AC中T-DNA片段的组成结构示意图。
[0010]图2 是AC转基因拟南芥植株的PCR分子鉴定结果以及获得的代表性转基因植株的照片。
[0011]图3 是AC转基因甘蓝型油菜植株的PCR分子鉴定结果以及获得的转基因植株的照片。
[0012]图4 是获得的转基因拟南芥植株中AC基因的表达水平与cAMP含量检测结果。[0013]图5 是获得的转基因甘蓝型油菜植株中AC基因的表达水平与cAMP含量检测结果。
具体实施方式
[0014]下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特别说明，本发明实施例中所用到的试剂和实验仪器均为分子生物学实验室中常用的试剂和仪器，所用方法也为分子生物学实验室中使用的常规技术方法。
[0015]实施例1 腺苷酸环化酶活性基因AC的克隆组装及其植物表达载体的构建
1、克隆编码腺苷酸环化酶催化活性中心的DNA序列片段：
根据文献记载（Al-Younis et al. 2015），拟南芥基因组中AT5G09400基因位点编码AtKUP7，其蛋白质序列中由100个氨基酸组成的氨基末端片段包含腺苷酸环化酶催化活性中心。因此，依据AtKUP7基因的DNA序列，设计能够对编码腺苷酸环化酶催化活性中心的DNA 片段进行特异性扩增的PCR引物：
KUP7-F1，5’-CACCATGGCGGAGGAAAGCAGTAT-3’，其中的下划线序列为AtKUP7基因的起始密码子；
KUP7-R1，5’-TTATTTCCTCCCAACGGTCAAG-3’，其中的下划线序列为添加的终止密码子序列。
[0016]准备野生型Col-0拟南芥幼苗材料，在液氮中研磨成粉末，利用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（生工生物工程有限公司）提取总RNA，随后利用反转录试剂盒HIScript® III RT SuperMix for qPCR (+ gDNA wiper) Reagent Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）合成cDNA模板，并使用2xPfu MasterMix PCR试剂（康为世纪生物科技有限公司）和上述引物配制PCR反应液，在Bio-Rad T100™ 热循环仪上进行PCR扩增，循环参数设定为：95℃预变性3min；30个循环的95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min；72℃延伸5min。
[0017]将获得的PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，可以看到一条319bp大小的DNA条带。
该DNA产物的序列由一个带有起始密码子ATG和终止密码子TAA的开放阅读框组成，转录表达后的翻译产物为由104个氨基酸组成的多肽或蛋白质，它具有与AtKUP7 中腺苷酸环化酶催化活性中心一样的氨基酸序列，在此将其命名为AC基因。
[0018]AC基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列为：
利用磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）对上述DNA条带进行提取并纯化，备用。
[0019]2、制备AC基因的Gateway™入门载体：
利用限制性内切酶Ahd I对1µg的pGWC质粒载体（Chen et al. 2006）DNA在37℃条件下进行酶切3h，将反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，可以看到一条2537bp大小的DNA 条带，利用上述磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行提取并纯化，获得pGWC的线性化DNA，与上述回收的AC基因片段混合，加入T4连接酶及反应缓冲液，置于4℃进行连接反应16h。取
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议