(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711018671.0
(22)申请日 2017.10.27
(71)申请人 天津科技大学
地址 300222 天津市河西区大沽南路1038
号
(72)发明人 刘夫锋 贾龙刚 路福平 王文娟
李玉 张会图
(74)专利代理机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理
事务所(普通合伙) 11617
代理人 栗华楠
(51)Int.Cl.
C07K 19/00(2006.01)
C07K 1/36(2006.01)
C07K 1/34(2006.01)
C07K 1/30(2006.01)
C07K 1/22(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 15/70(2006.01)G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，
具体涉及一种Aβ42修饰蛋白及其在大肠杆菌中
的表达及纯化方法。本发明构建的Aβ42表达体
系提供了原核生物表达人淀粉样蛋白Aβ42表达
载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌
表达宿主中，经诱导表达、两步纯化及鉴定后获
得具有高纯度生物活性的目标Aβ42-His蛋白。
本方法所采用的大肠表达系统，具有表达效率
高、表达量大、成本低、易操作等特点，所获得的A
β42多肽含有His标签方便纯化，且纯度高、产率
高，比化学合成Aβ42具有更好的聚集特性和细
胞毒性等优点。
权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图3页CN 107746432 A 2018.03.02
C N 107746432
A
1.一种A β42修饰蛋白，其特征在于，所述蛋白是在A β42的C端的添加6个His后形成的A β42-His蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的一种A β42修饰蛋白，其特征在于，所述A β42-His蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述A β42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，包括重组表达载体构建、转化、诱导表达以及纯化，步骤如下：
(1)将A β42基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET22b-A β42；
(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株；
(3)对重组菌株进行诱导，表达A β42-His蛋白；
(4)诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，使用含有尿素的变性溶液使包涵体变性；
(5)变性后过Ni-NTA树脂，进行亲和层析，采用洗脱液进行洗脱得A β42-His蛋白溶液；
(6)采用超纯水作为透析液对步骤(5)所得的A β42-His蛋白溶液进行透析；
(7)透析完成后高速离心后去掉上清收集沉淀，采用六氟异丙醇溶液溶解沉淀，均匀溶解后去除溶解不完全的杂质，吸取上清进行冻干处理，即得A β42-His蛋白。
4.如权利要求3所述的A β42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，具体如下：
(1)将SEQ ID No.3所示的A β42基因与pET22b表达载体连接转化，挑选阳性转化子验证，并提取pET2
2b-A β42质粒；
(2)将测序正确的pET22b-A β42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，获得大肠杆菌工程菌BL21-A β42；
(3)采用IPTG对工程菌BL21-A β42诱导蛋白表达，37℃诱导4h，菌液离心收集菌体，获得含有A β42-His蛋白的大肠杆菌菌体；
(4)用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入终浓度30μg/mL的溶菌酶和1％PMSF，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min，收集沉淀；
(5)将沉淀用含有尿素的变性溶液完全溶解后，高速离心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，清洗液清洗后，用洗脱液洗脱蛋白得A β42-His蛋白溶液；
(6)将上述A β42-His蛋白溶液用超纯水透析，通过高速离心，收集沉淀即为A β42-His纤维；
(7)将上述A β42-His纤维用六氟异丙醇溶解，超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻干处理，即得A β42-His蛋白单体。
5.如权利要求3所述的A β42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述变性溶液组成为：20mM Tris-HCl ,pH 8.0,150mM NaCl ,8M尿素,1mM DTT。
6.如权利要求3所述的A β42-His蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，步骤(5)所述洗脱液组成为：20mM Tris-HCl ,pH 8.0,150mM NaCl ,5M尿素,500mM咪唑,1mM DTT。
7.权利要求1所述A β42-His蛋白在淀粉样蛋白聚集性研究中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 107746432 A
一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
技术领域：
[0001]本发明属于生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种利用大肠杆菌表达 系统表达并纯化制备高纯度人淀粉样蛋白Aβ42修饰蛋白的方法，具体为重组大 肠杆菌表达载体的构建及转化方法、蛋白诱导表达及纯化方法。
背景技术：
[0002]淀粉样蛋白聚集成不溶性的淀粉纤维可导致各种神经性疾病，例如阿尔兹海 默症(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病。 这种疾病严重影响着世界上数以百万计的老年患者。据国际阿尔茨海默病协会 2016年公布的数据，2015年全球约有4680万AD患者，且其数量以20
年翻一 番的速度递增，预测2050年全球将有1.3亿AD患者。由于AD病程长(约10 年)且患者生活需要护理，因此医疗和护理花费惊人。2015年全球AD患者的 医疗花费约为8180亿美元，占全球GDP的1.1％。因此该疾病的病因和寻抗 AD药物成为世界范围内研究人员关注的焦点。
[0003]淀粉样蛋白斑(AD患者大脑中老年斑的主要成分)，主要是由淀粉样β-蛋 白(Aβ)聚集形成的，主要含有39-43个氨基酸。Aβ主要是通过一个含695-770 个氨基酸组成的淀粉样前体蛋白APP通过β-和γ-分泌酶水解而成，但该前体蛋 白的生物功能目前尚不清楚。据报道，Aβ42是大脑中老年斑的主要成分之一。 尽管目前对纤维形成过程中的聚集体的研究，已经取得了较大的进展，但很多关 于这些聚集体的大小、结构、形态以及与细胞毒性之间的关系等方面目前仍存在 很多未知的问题。
[0004]目前许多基于抑制Aβ42多肽聚集进行抗AD药物的设计和筛选，为探索其 聚集机制和毒理学性质，首先需要获得高纯度Aβ42。该多肽分子量大小约为4.5 kDa，含有胞外和跨膜结构域。目前Aβ多肽主要通过固相化学合成法(SPPS) 制备，然而SPPS合成过程中残留的氨基酸或多肽片段均严重影响了Aβ的聚集 和毒理特性。由于Aβ42自身存在高疏水性和易于聚集的特性，很难从神经细胞 组织中提取和纯化，因此难以获得大量高纯度的多肽。[0005]基因工程方法具有能够大量生产Aβ的优势，目前已有一些研究组设计出一 些表达系统，并表达纯化获得重组Aβ，然而由于Aβ的高疏水性和聚集体具有 较高的细胞毒性，利用传统的大肠杆菌表达系统依然存在表达量低、纯化步骤复 杂、获得Aβ纯度不高等缺点。利用可溶性蛋白与Aβ融合表达来增加其溶解性 和稳定性可解决上述制备Aβ的缺点，然而通过该方
法获得含有Aβ融合蛋白， 后续还需通过蛋白酶酶切去除融合蛋白，该方法不仅纯化过程繁琐复杂，还会造 成大量蛋白的损失。
[0006]pET22b表达载体是常用的大肠表达载体之一，载体上含有T7启动子，该启 动子为强诱导型启动子，具有较好的选择特异性和活性。经诱导后几乎能启动转 录细胞内所有类型基因，且能够极大提高插入基因片段的表达量。另外pET22b 表达载体多克隆位点C端自带His标签，为后续目标蛋白的纯化提供便利。
[0007]为了解决上述问题，本发明将提供一种简易的高纯度Aβ42修饰蛋白在大肠 杆菌中的表达及纯化方法，以获得高产、高纯度的Aβ42多肽，该多肽具有更强 的聚集特性和细
胞毒性，可替代目前研究中广泛使用的化学合成的Aβ42多肽。
发明内容：
[0008]为了实现上述目的，本发明提供一种简易的高纯度Aβ42修饰蛋白及其在大 肠杆菌中的表达及纯化方法。
[0009]本发明提供的技术方案之一，是一种Aβ42修饰蛋白，具体为Aβ42-His蛋 白，是在A β42的C端添加6个His后形成，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示， 其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010]本发明提供的技术方案之二，是上述Aβ42修饰蛋白在大肠杆菌中的表达及 纯化方法，包括重组表达载体构建、转化与筛选、诱导表达及纯化，步骤如下：
[0011](1)将Aβ42基因插入到表达载体pET22b的多克隆位点，构建重组表达载 体质粒pET22b-Aβ42；
[0012]优选地，所述Aβ42基因核苷酸编码序列如SEQ ID No.3所示；
[0013](2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞，经菌落PCR及测序 鉴定得到成功导入表达载体的重组菌株；
[0014]所述的宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；
[0015](3)诱导表达Aβ42-His蛋白，由于表达载体pET22b的C端含有His标签， 因此诱导表达获得Aβ42-His蛋白；
[0016]所述诱导表达使用的诱导剂为异丙醇-β-硫代半乳糖苷(IPTG)；
[0017](4)由于目标蛋白以包涵体形式表达，因此采用尿素溶液使包涵体变性的 方法纯化蛋白；诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，使用含有尿素的变性溶液使 包涵体变性；[0018]所述的尿素的浓度为8M；
[0019](5)变性后过Ni-NTA树脂，进行亲和层析，采用洗脱液进行洗脱得 Aβ42-His蛋白溶液；
[0020]所述洗脱液中含有浓度为5M的尿素；
[0021](6)采用超纯水作为透析液对步骤(5)所得的Aβ42-His蛋白溶液进行透 析，并利用Aβ42-His的疏水性促进其聚集形成淀粉样纤维；
[0022](7)透析完成后高速离心后去掉上清，采用六氟异丙醇溶液溶解絮状沉淀， 超声均匀溶解后高速离心去除溶解不完全的杂质，吸取80％上清进行冻干处理备 用，即得Aβ42-His蛋白。
[0023]本发明实现上述技术方案的过程具体如下：
[0024]1、表达载体及重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌的构建
[0025](1)根据大肠杆菌表达密码子偏好性对Aβ42基因序列进行优化，并由基 因公司合成，核苷酸序列如下：
[0026]G A T G C C G A G T T T C G C C A T G A T A G C G G C T A T G A G G T G C A C C A C C A G A A A C T G G T G T T C T T T G C C G A G G A T G T G G G C A G C A A C A A A G G C G C C A T T A T T G G CCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCC(SEQ ID No.3)；
[0027](2)将优化后Aβ42基因与pET22b表达载体连接，构建重组表达载体 pET22b-Aβ42；[0028]优选地，操作条件如下：
[0029]Aβ42基因片段与pET22b表达载体连接，16℃反应4-6h后，连接产物加入 到大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应90s，冰浴2min，加 入1mL LB液体培养基复苏液，250rpm，37℃孵育1h；
[0030]4000rpm离心5min收集菌体，重悬菌体后，涂布氨苄霉素抗性的LB培养 基平板，37℃培养过夜。挑取单菌落至液体培养基中，250rpm，37℃过夜培养 。
[0031]菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析，提取测序正确的阳性转化子质粒 备用；[0032]菌落PCR验证正向引物(NdeI)Aβ42-F：GGAATTCCATATGGATGCCGAGTT TCGCCATG(SEQ ID No.4)；
[0033]菌落PCR验证反向引物(XhoI)Aβ42-R：CCGCTCGAGGGCAATCACCACGC CACC(SEQ ID No.5)；
[0034](3)重组大肠杆菌表达菌株的构建：
[0035]将测序正确的pET22b-Aβ42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3) 中，菌落PCR验证转化子，最终获得重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌BL21 -Aβ42。
[0036]2、Aβ42-His蛋白的表达及纯化
[0037](1)Aβ42-His蛋白的表达：采用IPTG对工程菌BL21-Aβ42诱导蛋白表达， 37℃诱导4h，菌液离心收集菌体，获得含有Aβ42-His融合蛋白的大肠杆菌菌 体；
[0038](2)Aβ42-His蛋白的纯化：用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入终浓度 30μg/mL的溶菌酶和1％PMSF，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min， 收集上清和沉淀，SDS-PAGE凝胶电泳发现目标蛋白存在于沉淀中，即Aβ42-His 蛋白主要以包涵体形式表达；将沉淀用含有尿素的变性溶液完全溶解后，高速离 心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，清洗液清洗后，用10个柱体 积洗脱液洗脱蛋白，最终得到Aβ42-His蛋白溶液；[0039](6)透析并纯化Aβ42-His纤维：将上述Aβ42-His蛋白溶液用超纯水透析， 将咪唑等去除，同时利用蛋白的强疏水性加速其聚集形成纤维，通过高速离心， 收集沉淀即为Aβ42-His纤维；
[0040](7)获得高纯度Aβ42-His单体：将上述Aβ42-His纤维用六氟异丙醇溶解， 超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻 干处理，即得Aβ42-His蛋白单体。
[0041]上述Aβ42-His蛋白的鉴定：
[0042](1)电泳鉴定：Aβ42-His蛋白的表达及纯化包涵体蛋白过程中每一步都取 样进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示在5.6kDa附近有一条明显的条带；
[0043](2)质谱鉴定：将纯化所得Aβ42-His蛋白进行MALDI TOF/TOF质谱鉴定 分子量，结果表明所得产物确为目标Aβ42-His蛋白；
[0044](3)ThT荧光染分析聚集特性：将上述纯化所得Aβ42-His蛋白进行培养， 并按时间段取样进行ThT染，通过检测荧光值变化来分析聚集特性，证明本 发明所得Aβ42-His 蛋白比化学合成的人淀粉样蛋白Aβ42具有更强的聚集特性。
[0045]有益效果：
[0046]1、本发明构建的Aβ42表达体系提供了原核生物表达人淀粉样蛋白Aβ42的 表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导表达、 两步纯化及鉴定后获得具有高纯度生物活性的目标Aβ42-His蛋白，该蛋白是 Aβ42的修饰蛋白，在Aβ42的C
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