(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011482864.3
(22)申请日 2020.12.16
(71)申请人 西南大学
地址 400715 重庆市北碚区天生路2号
(72)发明人 牛国清 黄鹏举 孔德坤 王霞
王美燕 霍清雯
(74)专利代理机构 厦门市精诚新创知识产权代
理有限公司 35218
代理人 秦华
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/53(2006.01)
C12N 15/52(2006.01)
C12N 15/65(2006.01)
C12N 15/76(2006.01)
C12P 17/16(2006.01)C12R 1/47(2006.01) (54)发明名称
备方法和用途
(57)摘要
本发明公开了天然除草剂thaxtomins的高
产菌株及其制备方法和用途。该菌株来源于小白
链霉菌J1074，neo基因替换cebR基因，同时含有 thaxtomin生物合成基因簇：txtC和txtH基因， txtB基因，txtA基因，P rpoD 启动子，txtR基因，
txtE基因，txtD基因。本发明敲除了S.albus
J1074菌株中的负调控因子cebR基因；另一方面
改良了thaxtomin基因簇中的正向调控因子txtR
诱导剂“纤维二糖”的情况下，大量产生
thaxtomins，该菌株还可以稳定的复制和遗传，
为工业生产奠定了基础，
提高了产量。权利要求书1页 说明书10页序列表28页 附图6页CN 112501101 A 2021.03.16
C N 112501101
A
1.一株天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，该菌株来源于S.albus J1074，用neo基因替换掉cebR基因，同时含有thaxtomin生物合成基因簇，其中thaxtomin生
物合成基因簇依次包括：P450单加氧酶txtC基因，MbtH ‑like蛋白txtH基因，
非核糖体肽类合成酶txtB基因，非核糖体肽类合成酶txtA基因，P rpoD 启动子，正向调控因子txtR基因，P450单加氧酶txtE基因，一氧化氮合成酶txtD基因。
2.如权利要求1所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，所述thaxtomin 基因簇来源为疮痂链霉菌ATCC 49173。
3.如权利要求1所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，所述txtR的基因序列如SEQ ID NO:39所示。
4.如权利要求3所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，制备方法为，
thaxtomin基因簇的制备：
PCR分别扩增得到SEQ ID NO:11‑15所示的五个片段，通过酶切连接将其拼装成完整的thaxtomin基因簇，再通过λ‑RED介导的同源重组将基因簇转换到链霉菌整合载体上，获得带有thaxtomin基因簇的重组质粒A；
cebR基因敲除的突变菌株的制备：通过温敏型质粒介导的同源重组双交换，将小白链霉菌J1074CGMCC 4.7233基因组中的cebR基因替换为卡那霉素抗性基因neo，获得cebR基因敲除的突变菌株J1074ΔcebR；
Thaxtomin生物合成基因簇的制备：将SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，与线性化的pBluescript II KS(‑)载体同源重组，得到含有SEQ ID NO:36,39,37和38片段的重组载体B，；然后将重组载体B上的SEQ ID NO:36,39,37和38片段通过内切酶切下，再通过λ‑RED介导的同源重组系统，将SEQ ID NO:36,39,37和38片段与重组质粒A进行同源重组，获得带有thaxtomin生物合成基因簇的重组质粒C；
菌株的筛选：将重组质粒C通过链霉菌‑大肠杆菌穿梭系统接合转移至突变菌株J1074ΔcebR中，通过安普霉素筛选突变株，最终获得thaxtomin的高产菌株。
5.权利要求1‑4所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株用于制备thaxtomins的用途。
权 利 要 求 书1/1页CN 112501101 A
天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其涉及天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途。
背景技术
[0002]天然除草剂thaxtomin A(结构式见图1)发现于可以导致马铃薯疮痂病的几种链霉菌中，包括“Streptomyces scabiei，Streptomyces acidiscabies，Streptomyces turgidiscabies，Streptomyces europaeiscabiei，Streptomyces stelliscabiei”(Loria,R.,Kers,J.,&Joshi,M.(2006).Evolution of plant pathogenicity in Strept omyces.Annu.Rev.Phytopathol.,44,469‑487)。Thaxtomins系列产物能够抑制植物纤维素合成，导致植物块根或者块茎木栓质化，因而呈现出疮痂癍症状(Lawrence,C.H.,Clark, M.C.,&King,R.R.(1990).Induction of common scab symptoms in aseptically cultured potato tubers by the vivotoxin,thaxtomin.Phytopathology,80(7),606‑608.)。已经发现由于其纤维素合成抑制的特性，赋予了thaxtomins良好的除草剂性质(King,R.R.,Lawrence,C.H.,&Gray,J.A.(2001).Herbicidal properties of the thaxtomin group of phytotoxins.Journal of agricultural and food chemistry,49 (5),2298‑2301.)。有研
究表明，thaxtomins可用于控制农田杂草而不影响农作物生长(Koivunen M,Marrone P.Uses of thaxtomin and thaxtomin compositions as herbicides:U.S.Patent 10,010,079[P].2018‑7‑3.)；以及可用于控制水生植物中的藻类杂草(Kang,Y.,Semones,S.,Leder,J.,&Tran,A.(2011).U.S.Patent No.7,989, 393.Washington,DC:U.S.Patent and Trademark Office.)。目前thaxtomins的生产方法有生物合成和化学合成，而化学合成工艺复杂，耗能较高，限制了thaxtomins的生产应用(Zhang,H.,Ning,X.,Hang,H.,Ru,X.,Li,H.,Li,Y.,...&Wang,X.(2013).Total synthesis of thaxtomin A and its stereoisomers and findings of their biological activities.Organic letters,15(22),5670‑5673.)。而由于thaxtomin原始产生菌的产量低和需要消耗诱导剂等缺陷，限制着生物合成的进一步发展。链霉菌中普遍存在的cebR基因是thaxtomin生物合成的负调控因子，通过结合thaxtomin生物合成基因簇中的两个cbs (CebR binding site)位点，发挥对thaxtomin合成的抑制作用(Francis,I.M.,Jourdan, S.,Fanara,S.,Loria,R.,&Rigali,S.(2015).The cellobiose sensor CebR is the gatekeeper of Streptomyces scabies pathogenicity.MBio,6(2),e02018‑14.)。近年来，已经有不少在thaxtomin高产方面的努力(Jiang,G.,Zhang,Y.,Powell,M.M.,Zhang, P.,Zuo,R.,Zhang,Y.,...&Ding,Y.(2018).High‑yield production of herbicidal tha xtomins and tha xtomin analogs in a nonpa thogenic Streptomyces strain.Appl.Environ.Microbiol.,84(11),e00164‑18.)(Loria R,Jourdan S,Rigali S, et al.Methods for thaxtomin production and modified streptomyces with increased thaxtomin production[P].2016‑03‑24.)(娄春波，赵学金.提高thaxtomin发
酵产量的方法：CN109554415[P].2019‑04‑02)(Yousong,Ding.,Guangde,Jiang.Methods for thaxtomin production in engineered non‑native streptomyces in the absence of cellobise[P].2019‑06‑06)，但是以上的报道并没有在异源宿主中敲除thaxtomin生物合成的负调控因子，宿主对于thaxtomin的产生仍然具有严密调控。
发明内容
[0003]本发明目的在于提供天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其利用该菌株生产天然除草剂thaxtomins的高产办法。该菌株可以稳定的复制和遗传，同时可以在没有诱导剂“纤维二糖”的情况下，大量产生thaxtomins，为工业生产节省了成本，提高了产量。[0004]为实现上述目的，本发明提供一种天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，该菌株来源于S.albus J1074，用neo基因替换掉cebR基因，同时含有thaxtomin生物合成基因簇，其中thaxtomin生物合成基因簇依次包括：P450单加氧酶txtC基因，MbtH‑like蛋
启动子，白txtH基因，非核糖体肽类合成酶txtB基因，非核糖体肽类合成酶txtA基因，P
rpoD
正向调控因子txtR基因，P450单加氧酶txtE基因，一氧化氮合成酶txtD基因。
[0005]进一步，所述thaxtomin基因簇来源为疮痂链霉菌ATCC 49173。
[0006]进一步，txtR的基因序列如SEQ ID NO:39所示，txtC，txtH，txtB，txtA，txtE和txtD的序列见Ding Y,Jiang G.METHODS FOR THAXTOMIN PRODUCTION IN ENGINEERED NON‑NATIVE STREPTOMYCES IN THE ABSENCE OF CELLOBIOSE:U.S.Patent Application 16/768,347[P].2020‑11‑19。
[0007]进一步，制备方法为，
[0008]thaxtomin基因簇的制备：PCR分别扩增得到SEQ ID NO:11‑15所示的五个片段，通过酶切连接将其拼装成完整的thaxtomin基因簇，再通过λ‑RED介导的同源重组将基因簇转换到链霉菌整合载体上，获得带有thaxtomin基因簇的重组质粒A；
[0009]cebR基因敲除的突变菌株的制备：通过温敏型质粒介导的同源重组双交换，将小白链霉菌J1074CGMCC 4.7233基因组中的cebR基因替换为卡那霉素抗性基因neo，获得cebR 基因敲除的突变菌株J1074ΔcebR；
[0010]Thaxtomin生物合成基因簇的制备：将SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO: 37和SEQ ID NO:38，与线性化的pBluescript II KS(‑)载体同源重组，得到含有SEQ ID NO:36,39,37和38片段的重组
载体B，；然后将重组载体B上的SEQ ID NO:36,39,37和38片段通过内切酶切下，再通过λ‑RED介导的同源重组系统，将SEQ ID NO:36,39,37和38片段与重组质粒A进行同源重组，获得带有thaxtomin生物合成基因簇的重组质粒C；
[0011]菌株的筛选：将重组质粒C通过链霉菌‑大肠杆菌穿梭系统接合转移至突变菌株J1074ΔcebR中，通过安普霉素筛选突变株，最终获得thaxtomin的高产菌株。
[0012]本发明还包含所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株用于制备thaxtomins的用途。
[0013]本发明的发明人从多个小白链霉菌J1074的启动子中筛选得到启动效果最好的启动子“P
”进行基因簇的分子改造。
rpoD
[0014]本发明通过克隆thaxtomin基因簇，并在异源宿主中进行异源表达，以及敲除宿主中的cebR基因，排除宿主中负调控的抑制，使得可以在不添加诱导剂(纤维二糖)的情况下，
大量生产thaxtomins。另一方面，通过替换基因簇中txtR基因的启动子，获得了改良的thaxtomin生物合成基因簇。Thaxtomin的生物合成基因在几种致病性的链霉菌中都有存在，并且都处在一个称为“毒力岛”
的区域内。本发明采用分段扩增酶切连接的方法，从疮痂链霉菌ATCC49173的基因组中克隆完整的thaxtomin基因簇。
[0015]首先根据thaxtomin基因簇的特征，利用基因簇中原有的酶切位点(SacⅠ，NsiⅠ，NcoⅠ和NotⅠ)将基因簇分为五个片段，依次通过链式聚合酶反应(PCR)从疮痂链霉菌ATCC 49173的基因组中扩增出来。然后在限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用下，将五个DNA片段连接成完整的thaxtomin基因簇，并通过sanger测序确定基因簇完整正确。获得的thaxtomin基因簇在pBluescript II KS(‑)质粒上，因为这个质粒具有多克隆位点(MSC)，这为基因簇的拼装提供了很大优势。随后利用λ‑RED介导的同源重组将thaxtomin基因簇从pBluescript II KS(‑)载体上转移到EcoRⅤ线性化的pSET152载体上，其中被切开的lacZ 基因作为左右侧的同源臂。以此获得了pSET152::txt重组质粒。
[0016]小白链霉菌J1074基因组中含有thaxtomin生物合成的抑制因子cebR基因，利用同源重组双交换的方法，将其敲除。首先，我们构建了pKC1139::ΔcebR质粒(图7)，将其通过大肠杆菌‑链霉菌穿梭系统，导入到S.albus J1074中，然后在50mg/L安普霉素的筛选下，挑选具有抗性的转化子，将这些转化子在50mg/L卡那霉素的筛选下培养3天，40℃，200rpm；随后将一部分菌液在无抗培养基中培养3天，40℃，200rpm。将无抗培养基中的菌液稀释涂布在含有安普霉素的培养基平皿上，同时影印至含有卡那霉素的培养基平皿，筛选其中具有卡那霉素抗性并对安普霉素敏感的菌株。使用PCR验证cebR基因的成功敲除，在cebR基因两侧的同源臂上设计引物(图7)进行PCR扩增验证。验证结果如图8所示，成功的
获得了3个cebR基因缺失的突变株J1074ΔcebR。
[0017]在获得的thaxtomin基因簇中存在两个CebR蛋白结合位点——cbs(CebR Binding Site)，CebR蛋白是thaxtomin生物合成的抑制因子。本发明通过引物引入点突变的方法，将pSET152::txt质粒中的两个cbs进行点突变，获得重组质粒pSET152::txtΔcbs。
[0018]另一方面，本发明通过启动子筛选，获得了在小白链霉菌中的强启动子P
rpoD
。通过PCR从pSET152::txt质粒中扩增得到LH和txtR片段，从pUC119::neo质粒中扩增得到neo片
段，从S.albus J1074的基因组DNA中扩增获得P
rpoD 片段。将获得的LH、neo、P
rpoD
和txtR片段
通过同源重组试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit与线性化载体
pBluescript II KS(‑)进行同源重组，获得重组质粒pBS::LHneoP
rpoD
txtR(图9)。然后，将
片段LHneoP
rpoD
txtR从载体中切下，并与pSET152::txtΔcbs质粒进行λ‑Red介导的同源重
组，最终获得了P
rpoD
启动子替换掉原始txtR基因启动子的重组质粒pSET152::txtΔ
cbsP
rpoD
txtR，即为改良的thaxtomin生物合成基因簇。该改造的基因簇可以赋予宿主自由产生thaxtomins的能力，在不添加诱导剂“纤维二糖”的培养基中大量生产thaxtomins化合物。
[0019]将pSET152::txtΔcbsP
rpoD
txtR导入到J1074ΔcebR中，获得突变菌株J1074Δ
cebR‑txtΔcbsP
rpoD
txtR。将转化子接种在TSB培养基中于28℃，200rpm培养48h以获取种子液，随后将种子液以10％的比例添加进ISP4(International Streptomyces Project medium 4)培养基中发酵。将发酵液用乙酸乙酯萃取，随后真空蒸干获取晶体，溶解在甲醇中，通过C18反相硅胶柱进行产物纯化，获得thaxtomin A纯品。进行串联质谱(MS/MS)分析
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议