(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810352668.0
(22)申请日 2018.04.19
(71)申请人 江南大学
地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800
号
(72)发明人 蔡宇杰 熊天真 蒋静 丁彦蕊
白亚军 郑晓晖
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 林娟
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12P 7/42(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
应用
(57)摘要
本发明公开了一种工程菌及其以廉价底物
生产丹参素的应用，属于生物工程技术领域。本
所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂
羧酸脱氢酶；进一步地，本发明的重组菌还敲除
因、邻苯二酚转运基因、辅酶合成相关基因中的
任意一种或多种。本发明实现了丹参素的高效生
用价值。
权利要求书1页 说明书12页序列表4页CN 108949648 A 2018.12.07
C N 108949648
A
1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L -氨基酸氧化酶、L -乳酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述敲除的酚类物质分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、邻苯二酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、hpaX(邻苯二酚转运基因)、mhpT(邻苯二酚转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)、ribF(FAD合成基因)中的任意一种或多种。
7.根据权利要求1～3任一所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ和ribF，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、L -氨基酸氧化酶、L -乳酸脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶。
8.一种生产丹参素的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-7任一所述的重组菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生产丹参素是进行全细胞转化生产。
10.权利要求1-7任一所述的重组菌或者权利要求8-9任一所述的方法在化工、食品、制备药物领域的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 108949648 A
一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
[0002]提取自丹参的丹参素，学名R-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、D-(+)-β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：Danshensu、D-DSS、R-DSS、(R)-(+)-3-(3，4-Dihyd roxy phenyl)-la c tic a cid、(R)-(+)-3-(3，4-Dihyd roxy phenyl)-2-hydroxypropanoic acid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。[0003]丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，Ⅱ.D(+)β(3，4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的等方面具有独特作用。
[0004]当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利CN201
310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程图利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利CN201210190171.6提出了水解丹酚酸B生产丹参素的方法，丹酚酸B需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。
[0005]早在1988年Roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3，4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成S-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(S-DSS，L-DSS)的方法(Enzymatic Synthesis of(S)-(-)-3-(3，4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid，Arch.Pharm. (Weinheim)321，179-180(1988))。Z.Findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3，4-二羟基苯丙酮酸，然后再用D-乳酸脱氢酶还原生成D-(3，4-二羟基苯基)乳酸(Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed with D-lactateDehydrogenase from Lactobacillus leishmannii Using Genetic Algorithm，Chem.Biochem.Eng.Q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3，4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂。
发明内容
[0006]基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了一种新型的丹参素的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产丹参素的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术
问题。
[0007]本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯丹参素的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶。
[0008]在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来自于Erwinia herbicola ATCC 214344。
[0009]在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为P31011.2。
[0010]在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038或者Lactobacillus fermentum ATCC 14931。
[0011]在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为L型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusa strain DSM 20196或者Lactobacillus fermentum ATCC 14931。
[0012]在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_003643296.1、WP_002335374.1、或EEI22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为L-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_ 013858488.1、WP_003607654.1或WP_035430779.1的序列。
[0013]在一种实施方式中，D-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_GL379761REGION:COMPLEMENT(533562..534560)、NZ_KB944641REGION: 161892..162830、ACGI01000078REGION:20793..21791的序列；L-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_ATUM01000014REGION:39316..40254、NZ_ JQAY01000006REGION:69708..70640、NZ_GG669901REGION:45517..46470的序列。[0014]在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257。[0015]在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1序列。
[0016]在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509的序列。
[0017]在一种实施方式中，所述L-氨基酸氧化酶为的来自Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692、Morganella morganii ATCC 49993、Providencia rettgeri DSM 1131或Ignatzschineria larvae DSM 13226中的不产过氧化氢的L-氨基酸氧化酶。
[0018]在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_ 004244224.1、OAT30925.1、EFE55026.1、WP_036414800.1或WP_026879504.1的序列。[0019]在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：N Z_ GG668576REGION:1350390..1351805、LXEN01000066REGION:20563..21963、ACCI02000030REGION:21025..22443、NZ_LAGC01000006REGION:309569..310993、NZ_ KI783332REGION:35799..37217。
[0020]在一种实施方式中，所述重组菌，包括将编码酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、
α-羟基羧酸脱氢酶和L-乳酸脱氢的酶的基因，连接到2个质粒上，然后将重组质粒转化宿主大肠杆菌，得到重组工程菌。
[0021]在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶基因和L-乳酸脱氢酶基因是连接到质粒pETDuet-1后表达、L-氨基酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶基因是连接到质粒pACYCDue-1后表达。
[0022]在一种实施方式中，所述宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
[0023]在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。
[0024]在一种实施方式中，所述敲除的酚类物质分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。
[0025]在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是NCBI上accession NO 为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION: 339806..340750。
[0026]在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、邻苯二酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。
[0027]在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
[0028]在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、hpaX(邻苯二酚转运基因)、mhpT(邻苯二酚转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)、ribF(FAD合成基因)中的任意一种或多种。
[0029]在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accession NO为：NC_012892REGION: 3646638..3648293；hpaX为；NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)；mhpT为NC_012892REGION:344788..345999；nadA为NC_012892REGION:740487..741530；pdxJ为NC_ 012892REGION:complement(2567591..2568322)；ribF为NC_012892REGION:25479..26420。[0030]在一种实施方式中，所述重组菌是在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ和ribF，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、L-氨基酸氧化酶、L-乳酸脱氢酶
和α-羟基羧酸脱氢酶。
[0031]本发明的第二个目的是提供一种生产丹参素的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。
[0032]在一种实施方式中，所述生产丹参素，是进行全细胞转化生产。
[0033]在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，邻苯二酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相谱测定丹参素产量及构型。
[0034]本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。
[0035]本发明的有益效果：
[0036]本发明构建了一种新型的四酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯丹参素的生产。本发明选择的(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的D-丹参素和L-丹参素。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
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