(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011090640.8
(22)申请日 2020.10.13
(71)申请人 南京立顶医疗科技有限公司
地址 210000 江苏省南京市栖霞区仙林街
道仙林大学纬地路9号C6栋408、409、
410室
(72)发明人 张玉基 叶生宝 王鹏 王维
李叶 仲子进
(74)专利代理机构 合肥市浩智运专利代理事务
所(普通合伙) 34124
代理人 叶濛濛
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/535(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
(54)发明名称
剂盒及其检测方法
(57)摘要
本发明公开一种检测阿尔兹海默病的生物
标志物的试剂盒，涉及体外诊断技术领域，本发
液、发光底物液、校准品和质控品，并公开抗生物
标志物抗体包被的酶标板的制备方法。发明的有
益效果在于：在化学发光免疫分析基础上，引入
具有抗生物标志物抗体包被的酶标板，改进抗生
物标志物抗体包被工艺，提高反应的灵敏度，简
化了试剂生产流程，缩短了生产时间，为市场提
供质优价廉、稳定可靠、重复性好、批间差小、准
确度高的检测试剂盒。权利要求书1页 说明书10页 附图4页CN 112162101 A 2021.01.01
C N 112162101
A
1.一种检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：包括辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液、抗生物标志物抗体包被的酶标板、浓缩洗液、发光底物液、校准品和质控品；
所述抗生物标志物抗体包被的酶标板的制备方法包括以下步骤：
(1)往包被液中加入抗生物标志物抗体溶液至终浓度为2-4ug/ml；
(2)将步骤(1)中的溶液加入酶标板中进行恒温包被后，去除包被液，加入封闭液进行封闭；所述封闭液包括0.1M pH 7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液中包括1wt％BSA、0.1vol％Proclin300、0.1vol％动物血清、1％wt％鱼皮明胶、10％wt％蔗糖；
(3)去除封闭液，干燥后，即获得抗生物标志物抗体包被的酶标板。
2.根据权利要求1所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述包被液为0.01M的碳酸缓冲液，所述碳酸缓冲液的pH值为9.6±0.1。
3.根据权利要求1所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述动物血清为羊血清。
4.根据权利要求1所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述步骤(2)中包被温度为37±1℃，包被时间为1～3小时。
5.根据权利要求4所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述步骤(2)中封闭温度为37±1℃，封闭时间为2～5小时。
6.根据权利要求5所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中干燥温度为37±1℃，干燥时间为2～4小时。
7.根据权利要求1所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)将辣根过氧化物与NaIO 4混合，形成醛化酶；
(2)然后加入生物标志物抗体，形成斯夫氏硷；
(3)然后加入NaBH 4还原生成稳定的辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液。
8.根据权利要求1所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述抗生物标志物抗体包被的酶标板的包被浓度为0.5-4.0ug/ml。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，其特征在于：所述阿尔兹海默病的生物标志物为p -Tau -181蛋白或A β1-42蛋白。 10.如权利要求1-8中任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于：
(1)将校准品、质控品、待测样本依次加入抗生物标志物抗体包被的酶标板中，用膜封闭微孔反应板，置于37℃孵育1h；
(2)用浓缩洗液对孵育后的微孔反应板进行清洗；
(3)每孔加入辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液，加完以后，用膜封闭微孔反应板，置于37℃环境孵育1h；
(4)重复步骤(2)的洗板步骤，然后每孔加入发光底物液，在5min内用化学反发光仪器测量各孔的发光强度值。
权 利 要 求 书1/1页CN 112162101 A
一种检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒及检测方法。
背景技术
[0002]阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。是德国医生阿尔茨海默最先发现的一种脑神经疾病。它的主要症状有两个：一是β-淀粉样蛋白在神经元细胞外异常沉积形成的老年斑，二是tau蛋白的异常磷酸化所形成的NFTs(神经元纤维缠结)，严重影响患者的生活与社交功能，严重影响患者及至亲的生活质量。AD的病因及发病机制尚未明了，特征性病理改变为β-淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及小胶质细胞增生性神经炎和神经元丢失。这些主要的病理改变目前仍然是AD神经病理学诊断的标准。血清中的Aβ蛋白和tau蛋白可以作为AD临床实验室诊断的生物标志物。
[0003]Tau蛋白是一种微观相关蛋白，主要分布在神经元，其次是在神经胶质细胞。正常情况下，转录后的tau发生磷酸化修饰有利于微管的稳定。但过度磷酸化则可导致神经组织内各种类型的细胞骨架变形、
聚集，进而丧失正常的功能。Tau蛋白有多余45个磷酸化位点，其中大多位于脯氨酸富集区(即磷酸化位点富集区，大多为172-251位点区域)和C-末端尾区(大多位于368-441位点区域)。在tau蛋白这些区域的过度磷酸化可影响它与微管结合的能力。更为严重的是，tau蛋白的过度磷酸化可促进和增强tau蛋白的聚集。许多证据表明，在阿尔兹海默病及其他tau蛋白引起的病例过程中tau蛋白的过度磷酸化可能发生在最早起。Tau蛋白作为一种重要的微管相关蛋白，其异常修饰在神经退行性疾病中起重要的作用，对tau蛋白的相关功能及调控机制进行深入的研究可能为了解神经退行性疾病的临床和病理生理机制提供某些新的思路，为此类疾病的早期诊断和提供一定的依据。[0004]β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而产生的含有39～43个氨基酸的多肽。[0005]目前全球有超过5000多万的人患有痴呆。国际工作组(IWG)及美国国家老龄问题研究所修订了新的IWG诊断标准，即IWG-2诊断标准，发表于《Lancet Neurology》杂志上，这是目前为止最新的AD诊断标准。IWG-2诊断标准首次将AD生物标志物分为诊断标志物和进展标志物。脑脊液β-淀粉样蛋白和Ta u、淀粉样蛋白正电子发射型计算机断层显像(positron emission tomography，PET)和AD致病基因携带为AD的诊断标志物。然而，CSF和PET检查过于“高大上”，很难在大众体中被普及，也很难被大众所接受。因此，寻更加“接地气”的检测方法至关重要。
[0006]为了提高阿尔茨海默病诊断水平和改善效果，从检测角度上来说，公开号为CN109212225A的专利申请公开用层析的方法发明了一种磷酸化Tau蛋白检测试剂条过，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端。
[0007]目前应用较多的为化学发光技术，其中化学发光技术兴起于上个世纪80年代，是
继酶联免疫技术和放射性免疫技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定。如公开号为CN 109580955 A的专利申请公开用于检测Tau蛋白(TAU)的磁微粒分离化学发光免疫测定法，检测方法更准确、方便快捷。但是现有技术中试剂盒的稳定性较差。
发明内容
[0008]本发明所要解决的技术问题在于现有技术中阿尔兹海默病的生物标志物试剂盒的稳定性较差。
[0009]本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
[0010]一种检测阿尔兹海默病的生物标志物的试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的生物标记物抗体溶液、抗生物标志物抗体包被的酶标板、浓缩洗液、发光底物液、校准品和质控品；
[0011]所述抗生物标志物抗体包被的酶标板的制备方法包括以下步骤：
[0012](1)往包被液中加入抗生物标志物抗体溶液至终浓度为2-4ug/ml；
[0013](2)将步骤(1)中的溶液加入酶标板中进行恒温包被后，去除包被液，加入封闭液进行封闭；所述封
闭液包括0.1M pH 7.4的PBS缓冲液，所述PBS缓冲液中包括1wt％BSA、0.1vol％Proclin300、0.1vol％动物血清、1％wt％鱼皮明胶、10％wt％蔗糖；
[0014](3)去除封闭液，干燥后，即获得抗生物标志物抗体包被的酶标板。
[0015]有益效果：本发明的封闭液中以少量BSA屏蔽了酶标板大部分未结合位点，在缓冲体系的协同作用下，以动物血清消除非特异性结合位点，保证了包被板的精密度和低本底，以蔗糖和鱼皮明胶作为稳定体系，强化了包被板对高温、干燥的抗性，以Proclin300提高包被抗体耐腐蚀性，保证了抗生物标志物抗体包被板的性能。
[0016]本发明中的试剂盒在化学发光免疫分析基础上，通过引入具有抗生物标志物抗体包被的酶标板，并改进了抗生物标志物抗体包被工艺，通过双抗夹心的方法和化学发光体系，提高反应的灵敏度，节省生产成本，在降低抗体/抗原使用量的同时，也简化了试剂生产流程，缩短了生产时间，简化了检测步骤，可为市场提供质优价廉、稳定可靠、重复性好、批间差小、准确度高的检测试剂盒。
[0017]优选地，所述包被液为0.01M的碳酸缓冲液，所述碳酸缓冲液的pH值为9.6±0.1。[0018]优选地，所述动物血清为羊血清。
[0019]优选地，所述步骤(2)中包被温度为37±1℃，包被时间为1～3小时。
[0020]优选地，所述步骤(2)中封闭温度为37±1℃，封闭时间为2～5小时。
[0021]优选地，所述步骤(3)中干燥温度为37±1℃，干燥时间为2～4小时。
[0022]有益效果：本发明中的抗生物标志物抗体包被的酶标板在37℃下包被，缩短了包被时间，具有明显的效率优势，同时提高了反应的灵敏度，降低抗体/抗原使用量的同时，简化了试剂生产流程，缩短了生产时间。
[0023]优选地，所述辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
[0024](1)将辣根过氧化物与NaIO4混合，形成醛化酶；
[0025](2)然后加入标志物抗体，形成斯夫氏硷；
[0026](3)然后加入NaBH4还原生成稳定的辣根过氧化物酶标记的抗体溶液。
[0027]优选地，所述抗生物标志物抗体包被的酶标板的包被浓度为0.5-4.0ug/ml。[0028]优选地，所述辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液的浓度为0.03～5.0ug/ ml。
[0029]优选地，所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，所述发光底物液A的制备方法包括以下步骤：
[0030](1)称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、鲁米诺2.0g和对碘苯酚0.2mg于1L烧杯中；[0031](2)用量筒量取纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05之间；
[0032](3)用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得；
[0033]所述发光底物液B的制备方法包括以下步骤：
[0034](1)称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、过氧化脲0.2g和PC300 500μl于1L烧杯中；[0035](2)用量筒量取纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH控制其范围在7.95-8.05之间；
[0036](3)用0.2μm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
[0037]优选地，所述阿尔兹海默病的生物标志物为p-Tau-181蛋白或Aβ1-42蛋白。[0038]本发明还提供上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0039](1)将校准品、质控品、待测样本依次加入抗生物标志物抗体包被的酶标板中，用膜封闭微孔反应板，置于37℃孵育1h；
[0040](2)用浓缩洗液对孵育后的微孔反应板进行清洗；
[0041](3)每孔加入辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液，加完以后，用膜封闭微孔反应板，置于37℃环境孵育1h；
[0042](4)重复步骤(2)的洗板步骤，然后每孔加入发光底物液，在5min内用化学反发光仪器测量各孔的发光强度值。
[0043]检测原理：将样品加入到包被的酶标板中，样品中的生物标志物和该抗体结合形成免疫复合物。使用洗液清洗酶标板，去除未结合的游离成分。加入辣根过氧化物酶标记的生物标志物抗体溶液，该酶标抗体通过免疫反应与被固定的免疫复合物结合。再次清洗微孔板后，加入底物液激发化学发光，测定相对光强度RLU。在一定浓度范围内，RLU值随样品中生物标志物的升高而线性升高。
[0044]本发明的优点在于：本发明的封闭液中以少量BSA屏蔽了酶标板大部分未结合位点，在缓冲体系的协同作用下，以动物血清消除非特异性结合位点，保证了包被板的精密度和低本底，以蔗糖和鱼皮明胶作为稳定体系，强化了包被板对高温、干燥的抗性，以Proclin300提高包被抗体耐腐蚀性，保证了抗生物标志物抗体包被板的性能。
[0045]本发明中的试剂盒在化学发光免疫分析基础上，通过引入具有抗生物标志物抗体包被的酶标板，并改进了抗生物标志物抗体包被工艺，通过双抗夹心的方法和化学发光体系，提高反应的灵敏度，节省生产成本，在降低抗体/抗原使用量的同时，也简化了试剂生产流程，缩短了生产时间，简化了检测步骤，
可为市场提供质优价廉、稳定可靠、重复性好、批间差小、准确度高的检测试剂盒。
[0046]本发明中的抗生物标志物抗体包被的酶标板在37℃下包被，缩短了包被时间，具
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