一种载细胞生物打印水凝胶、生物墨水及制备方法和应用

1.本发明涉及生物医用高分子水凝胶技术领域，尤其涉及一种载细胞生物打印水凝胶、生物墨水及制备方法和应用。

背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.皮肤大面积创伤、器官组织损伤目前仍是医学上的难题，现有的方案普遍是依靠患者自身修复能力和器官移植。然而对于大面积创伤及器官损伤，人体难以自我修复，通常会采用自体移植或异体移植。通常来说，自体移植会对患者造成较大的二次伤害，异体移植难以匹配到合适的供体，因此器官损伤一直是医学领域的一大难题。
4.随着科学技术的进步，生物3d打印技术为组织器官修复提供了全新的临床医学策略，在医学领域的应用实例如组织器官替代品构建、器官移植与再生、药物筛选模型及解剖学模型等。生物3d打印可实现复杂组织结构打印、载细胞打印、不同细胞数量和细胞密度的可控精确沉积、容易获得生物材料理化性能梯度，在组织器官修复中占有诸多优势。能够负载活细胞的生物墨水对生物3d打印尤为重要，水凝胶材料合适的理化性能是细胞黏附、迁移、增殖的前提。因此，水凝胶材料需具有良好的生物相容性，既能为细胞生长提供特定的微环境，又是细胞功能化行为诱导的基础；同时须具有良好的可打印性、与组织细胞再生速度相匹配的降解速率、适合细胞生长的溶胀率、良好的力学性能。
5.在细胞的三维培养中，为保证可打印性，支架材料需要具有较高的弹性模量。而在体外培养时，支架的力学性能会影响细胞的存活、增殖和分化，不同的细胞对于支架的力学性能要求也不尽相同。因此为保证支架具有良好的生物相容性，需使支架的力学性能尽可能接近细胞在体内环境的力学性能。为了支持细胞的增殖和迁移以及营养物质的运输，要求生物支架具有一定的孔隙率。目前，制备一种综合性能良好的水凝胶材料仍是生物3d打印的难点。

技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种载细胞生物打印水凝胶，具有可调力学性能、可调孔隙率、高生物相容性、高打印精度、高定制性等优势，可广泛支持脊髓、软骨、心脏等人体组织的打印。本发明通过向基体材料中添加不同的细胞特异性材料，直接打印具有生物活性的组织，在组织修复、器官移植等方面有着良好的应用前景。
7.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
8.在本发明的第一目的是提供了一种载细胞生物打印水凝胶，以海藻酸盐、明胶为基体添加细胞特异性材料交联固化形成的聚合物凝胶，所述细胞特异性材料为多肽。
9.在本发明的第二目的是提供了一种载细胞生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
载细胞生物墨水前体制备：将海藻酸钠加入缓冲液中，加温搅拌溶解得到海藻酸盐溶液，将明胶、细胞特异性材料加入缓冲液中溶解，得到明胶复合溶液；将所述海藻酸盐溶液、明胶复合溶液混合均匀，得到生物墨水溶液；将细胞悬液进行离心，加入所述生物墨水溶液，将细胞吹散均匀，得到载细胞生物墨水。
10.本发明的另一优选的实施方式中，所述海藻酸盐的浓度范围为2％～5％w/v，所述明胶的浓度范围为2％～8％w/v。
11.本发明的另一优选的实施方式中，对于l929细胞，细胞特异性材料为多肽cmp27，所述海藻酸盐的浓度为2.5％w/v，所述明胶的浓度为6％w/v。
12.在本发明的第三目的是提供了一种制备载细胞支架的方法，包括如下步骤：将上述所述的制备方法制备的载细胞生物墨水加载到打印机针筒中，通过3d打印机上的气动喷嘴挤出到低温平台上以制备网格状载细胞支架，随后，4.5％w/v氯化钙溶液浸泡5min，使用pbs清洗得到最终结构。
13.在本发明的第四目的是提供了一种利用上述所述的制备载细胞支架的方法制备得到的载细胞支架。
14.在本发明的第五目的是提供了一种创口贴，包括上述所述的载细胞支架。
15.在本发明的第六目的是提供了一种悬浮浴挤出式打印制备组织器官的方法，包括如下步骤：将明胶悬浮浴固定在低温平台上，将利用上述载细胞生物墨水制备方法制备的载细胞生物墨水加载到生物3d打印机针筒中，通过气动喷嘴挤出打印到悬浮浴中，打印结束后升高低温平台的温度，释放打印结构，使用pbs清洗。
16.本发明的另一优选的实施方式中，包括：将配置好的含有5％(w/v)明胶、1％(w/v)cacl2溶液在4℃下孵育24h，加入3倍体积的cacl2溶液，使用破碎机破碎；将破碎得到的明胶颗粒离心，去除上清液，使用1％(w/v)cacl2溶液清洗三次后离心得到明胶浆料，转移至培养皿中。
17.本发明的第七目的是提供上述所述的载细胞生物打印水凝胶或上述所述的载细胞支架在生物医药领域中的应用。
18.本发明中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
19.1、本发明的载细胞3d打印生物墨水可以独立的调节打印结构的力学性能与生物学性能。通过调节基体材料的组分配比，可以同时实现凝胶的孔隙率与力学性能的定量调节。通过加入不同的添加材料组分，可以满足不同细胞的生物相容性要求，诱导细胞的迁移、分化。
20.2、本发明结合生物墨水设计了低温打印与悬浮浴打印两种方式构建打印结构，能够同时满足快速打印构建简单细胞支架与高精度打印构建复杂组织器官的要求，并且整个流程使用的均为天然生物材料，不会对细胞产生伤害。
21.3、针对该生物墨水，通过优化低温打印工艺，使得打印细胞存活率高达96％，打印过程简单迅速，可在5min内完成，实现载细胞敷料的快速定制打印应用；通过对悬浮浴打印工艺进行优化，使整个打印过程中温度保持在细胞适宜范围内，可满足长时间、大尺度复杂组织器官的打印应用。
22.本发明附加方面的优点将在下面的描述中给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
23.为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
24.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
25.图1是本发明实施例1中生物墨水的流变学测试结果，其中，图a为剪切恢复特征，图b为剪切变稀特征，图c为凝胶动力学特征；
26.图2是本发明实施例2中凝胶的弹性模量测试结果；
27.图3是本发明实施例2中凝胶扫描电镜下微观形貌图，图a至d分别为2％(w/v)、4％(w/v)、6％(w/v)、8％(w/v)明胶浓度的凝胶微观形貌；
28.图4是本发明实施例3中打印的支架结构，图(a)为支架明场显微图像，图(b)为支架免疫荧光染图像；
29.图5是本发明实施例3中打印的结构细胞培养增殖图；
30.图6是本发明实施例3中打印结构示意图。
31.为显示各部位位置而夸大了互相间间距或尺寸，示意图仅作示意使用。
具体实施方式
32.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
33.在本发明的具有可调力学性能的多功能载细胞生物3d打印水凝胶生物墨水包括以海藻酸盐(alginate)、明胶(gelatin)、细胞特异性添加材料为单体交联固化形成的聚合物凝胶。所述细胞特异性材料为多肽，根据不同的载细胞选择不同的多肽。针对l929成纤维细胞、成骨细胞、神经干细胞，可添加细胞粘附性多肽，包括并不限于rgd多肽、cmp27等胶原模拟多肽，针对皮肤组织细胞，可添加抗菌肽，包括并不限于ε-多聚赖氨酸、pmap类多肽、protegrin类多肽等。该水凝胶可以通过温敏交联与离子交联两种方式成型。通过调节海藻酸盐的浓度可以调节支架的弹性模量，通过调节明胶的浓度，可以调节在长期培养过程中的孔隙率。具体的：
34.海藻酸盐，分离于褐藻中，具有很高的生物相容性。海藻酸盐分子上的古洛糖醛酸可以与钙离子结合从而形成三维网络分子，以离子交联的形式形成水凝胶网络，该凝胶可以在培养基中长期稳定存在。通过改变凝胶中的海藻酸盐的浓度，可以改变凝胶的力学行为。
35.明胶，含有许多生物活性位点，既具有好的生物降解性又能调节细胞黏附，明胶溶液具有良好的温敏性，可以通过物理交联形成水凝胶网络。
36.本发明载细胞生物墨水制备方法包括如下步骤：
37.第一步：将2％～5％(w/v)的海藻酸盐溶解在1
×
pbs中，在37℃～40℃下搅拌2h，使用超声分散仪进行脱气处理，得到海藻酸盐溶液，并使用紫外线照射灭菌。
38.第二步：将明胶大分子前体溶解在1
×
pbs中，并添加细胞特异性材料，在37℃下搅
拌1h，使用超声分散仪进行脱气处理，得到明胶复合溶液，使用0.22μm过滤器灭菌。
39.第三步：在40℃下将海藻酸盐溶液与明胶复合溶液以1：1比例混合均匀，得到载细胞生物墨水前体溶液。
40.第四步：将培养的细胞以1
×
106ml-1的密度均匀分散在载细胞生物墨水前体溶液中，得到载细胞生物墨水。
41.使用上述所述的方法制备得到的载细胞生物3d打印生物墨水构建具有可调力学性能、孔隙率的载细胞支架。
42.根据特定组织的力学特性，通过调节生物墨水中海藻酸盐基体的浓度，调节打印组织的力学行为。根据细胞增殖、迁移的速率，通过调节生物墨水中明胶的浓度，调节在长期培养中组织支架的孔隙率。
43.本发明提供了低温挤出打印快速制备载细胞支架的方法：
44.将本发明的载细胞生物墨水存储在低温打印机针筒中，设置针筒温度为26℃，打印机平台温度设置为5℃。通过逐层打印的方式构建网格状细胞支架，打印完成后使用4.5％(w/v)cacl2溶液浸泡孵育5min，使用1
×
pbs清洗两次后，转移至完全培养基中培养。
45.本发明还提供一种载细胞水凝胶创面敷料，即采用上述载细胞支架制备的创口贴。
46.本发明还提供了一种体外组织高精度打印方法：
47.将本发明的载细胞生物墨水通过悬浮浴打印的方式体外构建高精度组织器官(精度为200μm)，以用于体外组织器官药物实验、器官移植等应用。
48.第一步：将配置好的含有5％(w/v)明胶、1％(w/v)cacl2溶液在4℃下孵育24h，加入3倍体积的cacl2溶液，使用破碎机破碎。将破碎得到的明胶颗粒离心(
×
2000g，10min)，去除上清液，使用1％(w/v)cacl2溶液清洗三次后离心(
×
2000g，10min)得到明胶浆料，转移至培养皿中。
49.第二步：将要打印的三维结构使用slic3r进行切片，生成g代码发送至打印机。
50.第三步：将装有明胶浆料的培养皿固定在打印机的低温平台上，平台温度设置为15℃，将本发明的载细胞生物墨水存储在低温打印机针筒中，设置针筒温度为26℃，将设计的结构打印至悬浮浴中。
51.第四步：打印完成后将打印平台温度上升到37℃，将打印结构从悬浮浴中释放。使用1
×
pbs清洗两次，转移至培养液中培养。
52.本发明所述的材料可以通过低温挤出式打印与悬浮于挤出式打印两种方法打印成型。其中低温挤出式打印可以快速构建简单的载细胞三维结构，可直接用于创面修复等应用；悬浮浴挤出式打印构建具有高精度的复杂结构，可用于构建组织器官。打印的结构具有可调的力学性能、可调孔隙率、高的生物相容性、高打印精度、高定制性等优势，在组织修复、器官移植等方面有着良好的应用前景。
53.实施例1
54.载细胞生物墨水的制备方法
55.1、制备海藻酸盐溶液：
56.称取0.5g海藻酸钠粉末，溶解在10ml的1
×
pbs(磷酸缓冲盐溶液)中，使用磁力搅拌器以920r/min的速度搅拌2h，搅拌的同时将溶液加热至40℃(并保持在此温度)直至海藻
酸盐完全溶解，得到5％(w/v)的海藻酸盐溶液。接下来使用超声波清洗器对海藻酸钠溶液脱气2min，然后转移至透明玻璃瓶中使用260nm紫外光照射24h灭菌。灭菌结束后转移至4℃环境下保存。
57.2、制备明胶/多肽cmp27复合溶液：
58.称取1.2g明胶粉末、4mg多肽cmp27(针对l929细胞的特异性添加材料，该多肽为现有的生物材
‑‑
胶原模拟多肽，作用是促进l929细胞黏附，参考文献：胶原模拟多肽及其对成纤维细胞粘附作用的研究)，溶解在10ml 1
×
pbs中，使用磁力搅拌器以700r/min的速度搅拌1h，搅拌的同时将溶液加热至37℃(并保持在此温度)直至溶剂完全溶解，得到明胶/多肽复合溶液。搅拌完成后使用超声波清洗器脱气2min，使用0.22um过滤器过滤灭菌。
59.3、制备载细胞生物墨水前体：
60.将制备好的海藻酸盐溶液和明胶/多肽cmp27复合溶液加热至40℃，以1：1的比例混合，使用漩涡振荡器混合均匀，墨水保持在40℃待用。
61.4、细胞培养及载细胞生物墨水的配制：
62.选择l929小鼠成纤维细胞，细胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的培养基中培养。将培养物保持在37℃，5％co2的加湿培养箱中，每隔一天换一次培养基。在配置生物墨水前，将细胞消化，计数细胞密度为3
×
106ml-1
。按生物墨水中1
×
106ml-1
的细胞密度吸取2ml细胞悬液，离心。吸取6ml生物墨水前体溶液吹散均匀细胞，配置成l929特异性载细胞生物墨水。
63.实施例2
64.低温挤出式打印构建载细胞三维网格支架
65.1、制备生物墨水：
66.同实施例1中步骤1、2、3。
67.2、制备负载l929细胞生物墨水：
68.同实施例1中步骤4。
69.3、打印载细胞三维网格支架：
70.将载细胞生物墨水转移至打印机针筒中，针筒温度设置为26℃，将墨水孵育10min后进行打印。打印方式为逐个打印，打印在φ35mm的培养皿中。打印平台温度设置5℃，针头规格为22g，层高0.3mm，打印速度100mm/min，移动速度为900mm/min，回轴速度为2000mm/min，brim width(边缘宽度)为1mm，brim speed(边缘打印速度)为100mm/min。打印压力为16kpa，打印三层网格结构，打印的尺寸为12.0mm
×
12.0mm，层高为0.3mm，间距1mm
×
1mm。
71.4、载细胞支架培养：
72.打印结束后使用5％(w/v)cacl2溶液浸泡5min进一步交联支架，接下来使用1
×
pbs清洗支架2次，将支架转移至含有10％(w/v)胎牛血清，1％(w/v)青霉素/链霉素的培养基中培养。培养物放置在37℃，5％co2的培养箱中。
73.实施例3
74.悬浮浴挤出式打印构建具有低弹性模量高精度复杂结构
75.1、制备生物墨水：
76.同实施例1中步骤1、2、3。
77.2、制备悬浮浴：
78.量取50ml超纯水，称取2.5g明胶颗粒，0.5g cacl2颗粒，使用磁力搅拌器以700r/min搅拌1h，搅拌的同时将溶液加热至37摄氏度。搅拌完成后使用超声波清洗器脱气2min，得到5％(w/v)明胶溶液。将明胶溶液转移至50ml离心管中，在4℃下孵育24h等待明胶交联。称取3g cacl2颗粒，溶解在300ml超纯水中配置成1％(w/v)cacl2溶液。接下来将交联好的明胶胶体切成10mm3的方块放入破碎机中，加入3倍体积的1％(w/v)cacl2溶液，以10000r/min的速度破碎60s的到明胶颗粒溶液。使用离心机在2000g的离心力下离心明胶颗粒溶液，去除上清液。再次加入3倍体积的1％(w/v)cacl2溶液，离心清洗明胶颗粒，得到明胶浆料。
79.3、悬浮浴打印工艺设置：
80.使用slic3r(3d切片软件)对设计的组织三维模型进行切片，设置layer height(层高)0.2mm，fill pattern(填充模式)为rectilinear(直线)，fill density(填充密度)为30％，切片完成后生成g代码发送到打印机。
81.将制备得到的明胶悬浮浴转移到φ35mm的小皿中，放置在打印机的低温平台上，设置低温平台的温度为15℃。将载细胞生物墨水转移至打印机针筒中，针筒温度设置为26℃，将墨水孵育10min后进行打印。针头规格为25g，层高0.2mm，打印速度100mm/min，移动速度为900mm/min，回轴速度2000mm/min，brim width(边缘宽度)为1mm，brim speed(边缘打印速度)为100mm/min，打印压力为30kpa。进行了一系列复杂空间结构的打印，如图6所示。
82.下面，通过以下几项测试说明实施例中的水凝胶材料在组织工程支架或载细胞打印组织应用中的优势。
83.1、流变学测试
84.对于本发明所述的载细胞水凝胶进行了流变学评价。如图1(a)所示，对于墨水的流动特性，在37℃下，0.01-1000r
·
s-1的剪切速率范围内对墨水的粘度进行了测试。可以看出不同浓度配比的剪切粘度在测量的剪切速率范围内随剪切速率的增大而减小，这表明所有的样品都表现出剪切变稀的行为。
85.另外对生物墨水的流变学特性进行了测试，如图1(b)，在37℃下，通过进行多组高低剪切速率变化的测量来模拟水凝胶从喷嘴中挤出的过程。如图可以看出，所有浓度配比的生物墨水，当剪切速率突变时，墨水的粘度发生剧烈变化。这种特性表明墨水打印过程中会以低粘度的状态通过喷嘴，一旦从喷嘴挤出，墨水的流动速率变为0，墨水则立即恢复高粘度的状态，有利于保持打印的结构。
86.对于细胞的凝胶动力学特性，我们在震荡模式下，以1hz的频率在4-37℃范围内对生物墨水进行了测试。如图1(c)可以发现在较低的温度下，墨水的储能模量g’大于损耗模量g”，此时墨水表现出固体的性质，在较高的温度下储能模量g”小于损耗模量，此时墨水表现出流体的性质。g’和g”的交点代表了溶胶-凝胶转换发生的温度。可以看出在升温与降温的过程中生物墨水的流变行为并不相同，墨水的凝胶温度低于溶胶温度10℃左右。这表明生物墨水非常适宜低温打印，并且在打印后可以在室温下保持固化状态。
87.2、力学性能测试
88.对于本发明所述的不同浓度生物墨水的力学特性进行了测试，从弹性模量的角度考察了生物墨水的可打印范围。测试结果如图2所示，可以得出在明胶浓度不变的情况下，凝胶的弹性模量与海藻酸盐的浓度近似成线性关系。海藻酸盐的浓度为1％(w/v)时，弹性模量为0.430
±
0.082mpa；当海藻酸盐的浓度增长到4％(w/v)，凝胶的模量随之增长到
1.137
±
0.087mpa。这表明在构建三维支架时，可以通过调节海藻酸盐的浓度来调节支架的弹性模量，从而满足不同细胞生存的力学要求。
89.3、水凝胶形貌观测
90.将本发明所述的水凝胶材料分别经固化、冷冻干燥、喷金后在扫描电镜下的形貌如图3所示。在海藻酸盐/明胶基体材料体系中，明胶对于支架的孔隙率具有重要的影响作用。在支架打印完成后，明胶会逐步从支架中释放出来形成一定的孔隙率。这里配置了明胶浓度为2％(w/v)、4％(w/v)、6％(w/v)、8％(w/v)的生物墨水，观察几种不同材料的孔隙率。当明胶的浓度为2％时，水凝胶微观形态展现为片层状，没有明显的微孔；明胶浓度为4％(w/v)时，片层中出现微小孔隙；当明胶浓度达到6％(w/v)时，水凝胶中出现大量孔隙，并且随着明胶浓度的增高，材料显现出更大的微孔结构，微孔分布更为均匀，这将有利于细胞的增殖与迁移，这也使得在细胞培养过程中，其他营养物质进出水凝胶，有利于细胞的新陈代谢。
91.4、细胞活性分析
92.为了衡量生物墨水的生物相容性，使用负载l929细胞的生物墨水打印了网格结构，观察细胞的活性与增殖情况。在培养的1、3、5、7天使用活/死染试剂盒对细胞活性进行分析。使用倒置荧光显微镜进行观测，如图4所示，使用imagej(图像处理软件)对活死、细胞进行计数。计算得到打印完成后细胞的存活率在96％以上，打印过程对细胞几乎没有影响，随着培养时间的延长，细胞保持着高的存活率，并且可以显著看到细胞大量增殖。
93.在培养的1、3、5、7天使用cck8试剂盒测试了细胞的增殖状况。在打印后第一天和第三天的测试显示吸光度并没有太大的变化，细胞数量大致保持不变，这主要是由于打印过程细胞外环境的变化。第5天和第7天的测试显示吸光度出现了大幅增长，细胞大量增殖。这表明打印过程不会对细胞的状态造成不可逆的损伤，并且使用的生物材料具有很好的细胞相容性，能够支持细胞的增殖与迁移。
94.上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
95.最后需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例以及实施例中的各个特征可以相互结合，均在本发明的保护范围之内。另外，上述方法中的全部或部分步骤可以在诸如一组计算机可执行指令的计算机系统中执行，并且，虽然所述步骤按照1、2、3
…
顺序列出，但是在某些情况下，可以以不同于此处的顺序执行所示出或描述的步骤。

技术特征：

1.一种载细胞生物打印水凝胶，其特征在于，以海藻酸盐、明胶为基体添加细胞特异性材料交联固化形成的聚合物凝胶，所述细胞特异性材料为多肽。2.一种载细胞生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：载细胞生物墨水前体制备：将海藻酸钠加入缓冲液中，加温搅拌溶解得到海藻酸盐溶液，将明胶、细胞特异性材料加入缓冲液中溶解，得到明胶复合溶液；将所述海藻酸盐溶液、明胶复合溶液混合均匀，得到生物墨水溶液；将细胞悬液进行离心，加入所述生物墨水溶液，将细胞吹散均匀，得到载细胞生物墨水。3.如权利要求2所述的载细胞生物墨水的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠的浓度范围为2％～5％w/v，所述明胶的浓度范围为2％～8％w/v。4.如权利要求2所述的载细胞生物墨水的制备方法，其特征在于，对于l929细胞，细胞特异性材料为多肽cmp27，所述海藻酸钠的浓度为2.5％w/v，所述明胶的浓度为6％w/v。5.一种制备载细胞支架的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求2-4任一项所述的制备方法制备的载细胞生物墨水加载到打印机针筒中，通过3d打印机上的气动喷嘴挤出到低温平台上以制备网格状载细胞支架，随后，4.5％w/v氯化钙溶液浸泡5min，使用pbs清洗得到最终结构。6.利用如权利要求5所述的制备载细胞支架的方法制备得到的载细胞支架。7.一种创口贴，其特征在于，包括如权利要求6所述的载细胞支架。8.一种悬浮浴挤出式打印制备组织器官的方法，其特征在于，包括如下步骤：将明胶悬浮浴固定在低温平台上，将利用权利要求2所述方法制备的载细胞生物墨水加载到生物3d打印机针筒中，通过气动喷嘴挤出打印到悬浮浴中，打印结束后升高低温平台的温度，释放打印结构，使用pbs清洗。9.如权利要求8所述悬浮浴挤出式打印制备组织器官的方法，其特征在于，包括：将配置好的含有5％(w/v)明胶、1％(w/v)cacl2溶液在4℃下孵育24h，加入3倍体积的cacl2溶液，使用破碎机破碎；将破碎得到的明胶颗粒离心，去除上清液，使用1％(w/v)cacl2溶液清洗三次后离心得到明胶浆料，转移至培养皿中。10.权利要求1所述的载细胞生物打印水凝胶或权利要求6所述的载细胞支架在生物医药领域中的应用。

技术总结

本发明涉及生物医用高分子水凝胶技术领域，尤其涉及一种载细胞生物打印水凝胶、生物墨水及制备方法和应用。载细胞生物打印水凝胶，以海藻酸盐、明胶为基体添加细胞特异性材料交联固化形成的聚合物凝胶，所述细胞特异性材料为根据不同的载细胞选择的多肽。利用该水凝胶打印的结构具有可调力学性能、可调孔隙率、高生物相容性、高打印精度、高定制性等优势，可广泛支持脊髓、软骨、心脏等人体组织的打印，在组织修复、器官移植等方面有着良好的应用前景。用前景。用前景。