(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810141218.7
(22)申请日 2018.02.09
(71)申请人 广东优尼德生物科技有限公司
地址 523000 广东省东莞市东莞松山湖高
新技术产业开发区台湾高科技园桃园
路1号莞台生物技术合作育成中心3栋
4楼
(72)发明人 夏宣喜 赖华 孔浩杰 刘志文
(74)专利代理机构 深圳市世纪恒程知识产权代
理事务所 44287
代理人 胡海国 徐进之
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/92(2006.01)
(54)发明名称一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法(57)摘要本发明公开一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，其中，所述检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。本发明的检测脂联素的胶体金试纸条具有方便快捷，操作简单，耗时较短， 便于临床推广应用等优点。权利要求书2页 说明书9页 附图2页CN 108169494 A 2018.06.15
C N 108169494
A
1.一种检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，其特征在于，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；
所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。
2.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片处，所述检测窗口位于所述测试带和所述控制带处。
3.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：
分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；
将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；
用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；
将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；
再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。
4.如权利要求3所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；
所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
5.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分
钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；
将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；
将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
6.如权利要求5所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08:0.08:15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围
为10nm～11nm。
7.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述样本垫片为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求1所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜相对应的检测信号值。
9.如权利要求8所述的检测脂联素的胶体金试纸条，其特征在于，所述梯度质量浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L。
10.一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；
利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片上；
待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带信号值和控制带信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。
一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法。
背景技术
[0002]脂肪组织(adipose tissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。正常人血清中脂联素的浓度范围在3～30μg/mL，占血浆蛋白总量的0.01％，不随饮食或昼夜节律而改变，女性血清中的脂联素含量大于男性。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症患者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加。测定血中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。[0003]而现有技术中一般采用酶联免疫分析试剂盒来检测脂联素浓度，虽然酶联免疫法检测的准确度较高，但是该方法检测过程繁琐，耗时较长，且样本需要批量检测，不适用于及时检测。
发明内容
[0004]本发明的主要目的是提出一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，具有方便快捷、操作简单、耗时较短的特点。
[0005]为实现上述目的，本发明提出的检测脂联素的胶体金试纸条，包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端
粘贴有耦合物结合垫片，另一端粘贴有吸水垫片，所述耦合物结合垫片上粘贴有样本垫片；所述硝酸纤维素膜上设置有测试带和控制带，所述测试带内包被有鼠抗脂联素抗体，所述控制带内包被有兔抗鼠抗体；所述耦合物结合垫片包被有胶体金标记脂联素抗体。
[0006]优选地，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括壳体，所述壳体上设置有加样窗口和检测窗口，所述加样窗口位于所述样本垫片处，所述检测窗口位于所述测试带和所述控制带处。
[0007]优选地，所述硝酸纤维素膜按如下步骤制备：
[0008]分别将测试带抗体原液和控制带抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60min，吸取两种上清液；
[0009]将两种上清液分别装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到测试带抗体和控制带抗体；
[0010]用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液分别稀释两种抗体，得到0.8mg/ ml测试带包被液和0.8mg/ml控制带包被液；
[0011]将所述测试带包被液和所述控制带包被液分别喷涂在硝酸纤维素膜对应的测试带和控制带位置，喷涂量为1μL/cm；
[0012]再将包被好硝酸纤维素膜置于37℃温度下烘干。
[0013]优选地，所述样本稀释液包括磷酸盐缓冲液和/或Tris缓冲液。所述磷酸盐缓冲液按重量计包括：Na2HPO40.263-0.376份，KH2PO41.000-1.109份，NaCl6份，KCl0.2份，蒸馏水1000份；
[0014]所述Tris缓冲液按重量计包括：三羟甲基氨基甲烷4.6-5.5份，KH2PO42.0-3.0份，NaCl8份，KCl0.4份，牛血清白蛋白9份，蒸馏水1200份。
[0015]优选地，所述胶体金标记脂联素抗体按如下步骤制备：
[0016]将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1∶79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠、质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将所述A液和所述B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
[0017]利用0.25M K2CO3调整所述胶体金液的pH值为6.8～7.1；
[0018]将人血清白蛋白标记抗体原液在4℃下6000～13000r/min离心60分钟，吸取上清液；将所述上清液装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到脂联素抗体；[0019]将0.27～0.30mg脂联素抗体缓慢加入100ml胶体金液中进行标记，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl和1％牛血清白蛋
白100μl，搅匀后在2.5～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记脂联素抗体。
[0020]优选地，所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4:0.08:0.08:15.84，所述胶体金液中胶体金颗粒的直径范围为10nm～11nm。
[0021]优选地，所述样本垫片为经过pH值为6.5～6.7的封闭液封闭处理的玻璃纤维垫片，所述封闭液为含有2.0％吐温-20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
[0022]优选地，所述检测脂联素的胶体金试纸条还包括定标卡，所述定标卡为人脂联素梯度质量浓度溶液所检测颜相对应的检测信号值。
[0023]检测信号值。
[0024]优选地，所述梯度质量浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L。
[0025]本发明还提出一种检测脂联素的胶体金试纸条的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0026]采集血样2～3ml，室温放置15min-120min，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液至样本稀释液中混匀，即得待测样本；
[0027]利用移液器准确吸取80μL待测样本，滴加在检测脂联素的胶体金试纸条的样本垫片上；
[0028]待测样本层析完全后，检测胶体金试纸条的测试带信号值和控制带信号值，通过仪器结合定标卡信息计算待测样本的脂联素浓度，定量判定其质量浓度。
[0029]本发明提供了一种检测脂联素的胶体金试纸条及其定量检测方法，其中，所述检测脂联素的胶体金试纸条包括PVC衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫片、样本垫片及吸水垫片，所述PVC衬板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的一端粘贴有耦合物结合垫
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