(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710030948.5
(22)申请日 2017.01.17
(83)生物保藏信息
CGMCC No.13119 2016.10.17
(71)申请人 杭州皇冠农业生物工程技术研究中
心有限公司
地址 311300 浙江省杭州市临安市科技大
道发达路产业区块
(72)发明人 胡向东 叶茂 胡伟卿 梁新乐
(74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务
所(普通合伙) 11548
代理人 李静
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 13/00(2006.01)
C12N 15/03(2006.01)C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种阿维拉霉素高产菌株选
育方法，采用ARTP及三次137Csy诱变使链霉菌发
生突变，并采用2次原生质体融合进行基因重组。
有益效果为：经过四轮诱变与两轮原生质体融
合，得到融合高产菌株G2-31，其阿维拉霉素效价
达到2842.57 mg/L，是原始菌株11-10的4倍，经
连续传代试验，菌种状态稳定，表现出较高的工
业应用潜力。权利要求书2页 说明书8页CN 107201321 A 2017.09.26
C N 107201321
A
1.一种阿维拉霉素高产菌株，其特征在于：其保藏号为：CGMCC13119。
2.一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于以下步骤：
1） ARTP及第一次137Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及137Csy诱变，琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-1、F-2和F-28，冻干管保存；
2） 第二次137Csy诱变：再次用137Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；
3） 第一轮原生质体融合：将高产菌株B-1、F-2、F-28 、G-11、H-7和I-17分别在种子活化培养基中进行培养，收集菌丝体，加入溶菌酶，得到的六种原生质体，将其作为亲本进行原生质体融合，在含利福平的抗性平板上进行初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到融合株G1-4、G1-6、G1-20和G1-31，再生培养，冻干管保存；
4） 第三次137Csy诱变：对第一次融合的效价最高的菌种G1-6再次137Csy诱变，再利用琼脂块法初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株Y4、Y13和Y32，冻干管保存；
5） 第二轮原生质体融合：将效价提高的诱变株Y4、Y13和Y32重复第三步得到融合株G2-10和G2-31，测其效价，将融合株G2-31保藏。
3.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤1中ARTP照射时间为170~210s。
4.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤3中抗性平板上利福平含量为280~320mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤1、2、4链霉菌活化培养基的成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、MgSO 4·6H 2O0.7~1.2份、KNO 31.3~1.8份、K 2HPO 40.5~0.9份、FeSO 4·7H 2O0.01~0.03份、NaCl0.4~0.9份、Agar30~40份，pH为7.2~7.4。
6.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的再生培养基的配置为：在四个锥形瓶中分别都装有蔗糖10~15份、葡萄糖1~2份、蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、乌索酸0.00002~0.00004份、KH 2PO 40.025~0.05份、MgCl 2·6H 2O1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8
份、TES3~5份、海藻酸钠0.0001~0.0003份和琼脂4~8份，再分别加入单独灭菌的K 2H 2PO 40.002~0.004份、CaCl 2·2H 2O0.001~0.002份和NaOH0.0005~0.0009份。
7.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤5中抗性平板上利福平含量为480~520mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的步骤3和5中活化培养基为在步骤1、2、4中活化培养基中加入1~3份甘氨酸。
9.根据权利要求5所述的再生培养基，其特征在于：所述的微量元素溶液成份及其重量份为：ZnCl 20.0003~0.0005份、FeCl 3·6H 2O0.001~0.003份、CaCl 2·2H 2O0.0001~0.0003份、MnCl 2·4H 2O0.0001~0.0003份、NBB 4O 7·10H 2O0.0001~0.0003份、(NH4)6M 7O 24·4H 2O0.0001~0.0003份和10份蒸馏水。
10.根据权利要求1所述的一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，其特征在于：所述的链霉菌发酵培养基成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、豆粕粉30~40份、D-木糖7.5~8.2
份、L-缬氨酸2.4
~2.5份、大豆蛋白胨5.6
~
6.3份、MgSO40.52
~
0.61份、MnCl20.52
~
0.61份、
CaCO30.52
~0.61份，pH为7.2
~
7.4。
一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物选育技术领域，具体是一种一种阿维拉霉素高产菌株及其选育方法。
背景技术
[0002]阿维拉霉素(A v i l a m y c i n)又名卑霉素，是由绿产链霉（Streptomycesviridoehrongenes）经过发酵产生的一种寡糖类抗生素，由美国礼来公司最先研制开发并命名为效美素(Maxus 100)由于其独特的结构所导致的高安全性，其易降解导致的在肠道基本无残留和对环境污染小以及毒性小、不存在交叉耐药性等特点，因此被广泛用于畜禽饲料中作为添加剂使用，而且无需停药期。目前阿维拉霉素在世界上主要的养殖业国家，比如欧盟、日本、巴西等被大量使用，而在2005年被我国农业部批准进口使用[进口兽药再注册目录，(2005)外兽药证字56号]。近年来，我国对阿维拉霉素的生产研究也在相应的增加，有关的报道也在逐年的增加。
[0003]国内外对绿链霉菌及阿维拉霉素的研究基本上仍处于实验室研究阶段。研究内容包括菌种选育、培养基和培养工艺对细胞生长和阿维拉霉素生成的影响、链霉菌细胞内阿维拉霉素的提取与测定等。但至今仍存在一些关键问题有待解决，主要是阿维拉霉素合成的详细途径及调控因子不明确，无法确定阿维拉霉素生产运输机制等。总体归纳有三点：C1)对链霉菌产阿维拉霉素的基因调控及代谢网络了解不深；C2)主要采用传统育种方法，工作量大，机会性强；C3)筛选手段不精心设计、效率低、工作
量大。因此探索新的途径和手段，获得高产阿维拉霉素链霉菌菌株就成为产业化发展的关键问题和核心技术。
[0004]现有技术如中国知网中论文：王庆龄. 阿维拉霉素高产菌株选育[D]. 浙江工商大学， 2015.公开了阿维拉霉素是一种正糖霉素族中的寡糖类抗生素，作为一种新型促进消化和代谢调节饲料药物添加剂，以其高安全性、低毒性以及低残留被欧盟等国家批准使用。本文通过诱变及基因组重排的方法并结合利福平抗性压力，选育了高产阿维拉霉素生产菌。通过rpoB序列分析，阐述了重组菌利福平遗传抗性及代谢特性。建立了发酵液中阿维拉霉素无盐相液相谱测量法。该论文公布的高产阿维拉霉素生产菌产阿维拉霉素的产率还有待提高。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种无化学污染、安全性高、成本低、突变率高的诱变方法，效率高且能提高正向突变率的筛选方法，选育出阿维拉霉素产率高的菌株。
[0006]本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种阿维拉霉素高产菌株选育方法，具体步骤：
1）ARTP及第一次137Csy诱变：将原始菌株11-10活化培养，制备单孢子悬液，ARTP及
137Csy诱变，ARTP照射时间为170
~210s，较高的致死率有利于淘汰亲本和筛选突变株，同时
等离子诱变时间不能过长。琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到诱变高产菌株B-
1、F-2和F-28，冻干管保存。等离子诱变使用的是一种等离子体源，其能够在大气压下产生一股温度在25-40℃之间、并具有高活性离子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子可改变微生物的细胞壁及膜的通透性，引起相应基因损伤，从而使微生物的基因簇及代谢发生显著变化，最终致使基因发生突变。ARTP具有成本低、无化学污染、高安全性以及高突变率的优点；
2）第二次137Csy诱变：再次用137Csy进行诱变，再利用琼脂块法初筛，摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株G-11、H-7和I-17，冻干管保存；
3）第一轮原生质体融合：将高产菌株B-1、F-2、F-28 、G-11、H-7和I-17分别在种子活化培养基中进行培养，收集菌丝体，加入溶菌酶，得到的六种原生质体，将其作为亲本进行原生质体融合，在利福平浓度为280~320mg/L的抗性平板上进行初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到融合株G1-4、G1-6、G1-20和G1-31，再生培养，冻干管保存。再生平板使用前需在34~40℃的培养箱中预培养一天，或是在60~70℃的烘箱中烘25~35 min，以保证固体培养基表面的水分能够充分蒸发，从而减少由于再生
培养基表面的冷凝水所引起的原生质体破裂。原生质体融合技术不仅能够打破有性杂交重组基因以创造新种的界限，更重要的是能够扩大遗传物质的重组范围，能够将多种正向突变融合，得到集多种正向突变于一体的融合菌株；
4）第三次137Csy诱变：对第一次融合的效价最高的菌种G1-6再次137Csy诱变，再利用琼脂块法初筛，再进行摇瓶发酵复筛，测其效价，得到正向诱变株Y4、Y13和Y32，冻干管保存；
5）第二轮原生质体融合：将效价提高的诱变株Y4、Y13和Y32重复第三步，抗性平板上利福平含量为480~520mg/L，得到融合株G2-10和G2-31，测其效价，将融合株G2-31保藏，保藏号为CGMCC13119。随着原生质体的逐渐融合，筛选菌株的利福平抗性压力增大，在淘汰亲本的同时减轻了初筛的工作量；将融合株G2-31五次传代性能稳定，其正突变率成明显上升趋势；基因组重排技术是将分子进化的对象定向为整个基因组而非单个基因，从而可以更为广泛的对菌株的目的性状进行优化组合。此技术的最大优点就是不必了解菌株的遗传背景而只是从细胞水平上进行定向优化。使用基因组重排技术，能够快速实现链霉菌基因的突变和筛选，得到的融合株G2-31阿维拉霉素的产率高。
[0007]优选的，链霉菌活化培养基的成份及其重量份为：可溶性淀粉30~40份、MgSO 4·6H 2O0.7~1.2份、KNO 31.3~1.8份、K 2HPO 40.5~0.9份、FeSO 4·7H 2O0.01~0.03份、NaCl0.4~0.9份、Agar30~40份，pH为7.2~7.4。上述活化培养基能使处于冻干状态的链霉菌迅速活化，恢复生长活力并且进行生长繁殖，菌数扩增，得到足够下一步操作的数量。
[0008]优选的，再生培养基的配置为：在四个锥形瓶中分别都装有蔗糖10~15份、葡萄糖1
~2份、
蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、乌索酸0.00002~0.00004份、KH 2PO 40.025~0.05份、
MgCl 2·6H 2O1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8份、TES3~5份、海藻酸钠0.0001~0.0003份和琼脂4~8份，再分别加入单独灭菌的K 2H 2PO 40.002~0.004份、CaCl 2·2H 2O0.001~0.002份和NaOH0.0005~0.0009份。上述培养基不仅能稳定渗透压，保护原生质体不会因吸水过多涨破或因失水而失去活性，又能提供充足的营养物质，乌索酸和海藻酸钠促进细胞壁的合成，相比于现有技术，上述再生培养基能使细胞壁合成的速度加快，菌株活性强。
[0009]优选的，步骤3和5中活化培养基为上述活化培养基中加入1~3份甘氨酸。
[0010]优选的，微量元素溶液成份及其重量份为：ZnCl 20.0003~0.0005份、FeCl 3·
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