(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210224393.9
(22)申请日 2022.03.09
(71)申请人 扬州大学
地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号
(72)发明人 王益军 杜文慧 李维 陈煜东
王珊珊
(51)Int.Cl.
C12N 15/113(2010.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/46(2018.01)
(54)发明名称
玉米长链非编码RNA lncRNA25659及其用途
(57)摘要
本发明公开了一种来源于玉米的长链非编
码R N A l n c R N A 25659及其用途，所述的
lncRNA25659的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，
本发明通过RT ‑PCR证实lncRNA25659的表达被赤
霉素处理所抑制；通过CRISPR/Cas9技术，编辑
lncRNA25659的转基因株系，与转基因受体相比， 这表明lncRNA25659通过应答赤霉素诱导影响植
物的株高。
权利要求书1页 说明书6页序列表3页 附图3页CN 114540357 A 2022.05.27
C N 114540357
A
1.一种来源于玉米的长链非编码R N A ，其为l n c R N A 25659，其特征在于，所述lncRNA25659的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.用于扩增权利要求1所述的长链非编码RNA
lncRNA25659的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.含有权利要求1所述长链非编码RNA lncRNA25659的植物CRISPR/Cas9载体。 4.含有权利要求3所述植物CRISPR/Cas9载体的重组菌。
5.权利要求1所述的长链非编码RNA lncRNA25659、权利要求3所述的植物CRISPR/Cas9载体或权利要求4所述的植物CRISPR/Cas9载体重组菌在如下a)‑c)至少一项中的用途：
a)促进植物株高增加；
b)促进植物第2叶鞘变长；
c)促进植物内源赤霉素GA 3含量增加。
6.权利要求1所述的长链非编码RNA lncRNA25659、权利要求3所述的植物CRISPR/Cas9载体或权利要
求4所述的植物CRISPR/Cas9载体重组菌在改良植物株高中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物为玉米。
8.一种株高改良作物品种的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建SEQ ID NO.1的植物CRISPR/Cas9载体；
(2)将步骤(1)的植物C R I S P R /Ca s 9载体转化至植株中，编辑长链非编码R N A lncRNA25659，筛选得到株高改良的植株。
权 利 要 求 书1/1页CN 114540357 A
玉米长链非编码RNA lncRNA25659及其用途
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种玉米长链非编码R N A lncRNA25659及其在株高改良方面的用途。
背景技术
[0002]RNA聚合酶II转录产生两种类型的RNA，包括编码RNA和非编码RNA。根据成熟产物的大小，非编码RNA可进一步分为非编码小RNA和长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)(Kim and Sung,2012)。lncRNA的长度超过200bp，具有较低的蛋白编码潜能，不具有可读框(open reading frame,ORF)。lncRNA可以在基因组的多个区域产生，包括启动子、增强子、基因间区域转录均可产生lncRNA(Wu et al.,2017)。
[0003]长链非编码RNA lncRNA通过与靶标互作，调控基因表达、RNA加工、染质重排、蛋白活性等(Chekanova,2015)。相比于动物lncRNA研究领域，植物中lncRNA的功能研究较少。拟南芥lncRNA cold induced long antisense intragenic RNA(COOLAIR)与polycomb复合体互作，对春化途径基因FLOWERING LOCUS C(FLC)进行抑制(Swiezewski et al., 2009)。水稻成花激活基因OsSOC1反义转录产生lncRNA Early flowering‑completely dominant(Ef‑cd)，lncRNA Ef‑cd变异可以促进水稻提早开花(Fang et al.,2019)。过表达番茄lncRNA lncRNA39026诱导病程相关基因表达，调控番茄晚疫病抗性(Hou et al., 2020)。
[0004]植物激素赤霉素调控种子萌发、植株株高、花粉育性等(Wang et al.,2017)。赤霉素代谢基因semidwarf1(sd1)、信号调控因子Reduced height(Rht)变异导致的矮秆性状，是“绿革命”期间矮秆品种培育的突破点。基于突变体分析等方法，赤霉素合成、代谢、信号转导的通路被解析。前体trans‑geranylgeranyl diphosphate(GGPP)通过多步酶促反应，合成赤霉素。GA 2‑oxidase(GA2ox)参与
赤霉素代谢。赤霉素、GA INSENSITIVE DWARF1 (GID1)受体、DELLA蛋白形成的GA–GID1–DELLA模块被用来解释赤霉素信号转导过程(Blázquez et al.,2020)。
[0005]长链非编码RNA lncRNA在转录及转录后水平调控多个生物学过程，但调控玉米株高相关的lncRNA未见报道。
发明内容
[0006]针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种来源于玉米的长链非编码RNA lncRNA25659，探索其在植物激素赤霉素响应中的机制，进而利用该长链非编码RNA改良玉米的株高，创制株高改良的玉米新品种。
[0007]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]本发明的第一方面，提供一种来源于玉米的长链非编码RNA，命名为lncRNA25659，具有：
[0009]1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
[0010]2)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上序列同源性，且功能上与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列等同。
[0011]进一步的，本发明还提供用于扩增上述玉米长链非编码RNA lncRNA25659的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0012]本发明的第二方面，提供含有上述玉米长链非编码RNA的植物CRISPR/Cas9载体。[0013]进一步的，本发明还提供包含上述植物CRISPR/Cas9载体的重组菌。
[0014]本发明的第三方面，提供上述玉米长链非编码RNA、植物CRISPR/Cas9载体或重组菌在如下a)‑c)至少一项中的用途：
[0015]a)促进玉米株高增加；
[0016]b)促进玉米第2叶鞘变长；
[0017]c)促进玉米植株内源赤霉素GA
3
含量增加。
[0018]本发明的第四方面，提供上述长链非编码RNA、植物CRISPR/Cas9载体或重组菌在植物育种中的用途。所述植物育种为培育株高改良的品种。
[0019]本发明的第五方面，提供一种改良植物株高的方法，包括：将本发明第二方面所述的植物CRISPR/Cas9载体导入受体植物；优选地，所述植物为玉米。
[0020]本发明的有益效果：
[0021]本发明首次从玉米叶鞘组织中分离到一个与植物株高相关的长链非编码RNA lncRNA25659。本发明的lncRNA25659可以为株高性状种质改良、培育株高改良品种提供新的选择思路与靶标。
附图说明
[0022]图1：RT‑PCR分析长链非编码RNA lncRNA25659的表达。M表示DNA marker，DNA分子
量标准为DL2000，water表示水处理的样品，GA
3表示赤霉素GA
3
溶液处理的样品。取样三叶期
第2叶鞘提取RNA进行检测。箭头表示目的条带位置。
[0023]图2：转基因株系基因型检测PCR产物凝胶电泳图谱。提取单株叶片DNA，根据长链非编码RNA lncRNA25659序列设计引物进行基因型检测。M表示DNA marker，DNA分子量标准为DL2000，剩余泳道为检测的转基因株系DNA样品。扩增目的产物的大小468bp。箭头表示目的条带位置。
[0024]图3：转基因受体、lncRNA25659转基因T3代株系苗高。根据PCR产物测序鉴定的结果，选择基因型纯合的lncRNA25659转基因T3代株系与转基因受体测定苗高，进行差异显著性分析。A)转基因受体、lncRNA25659转基因T3代株系幼苗表型，标尺为5cm。B)转基因受体、lncRNA25659转基因T3代株系苗高显著性测验，**表示P<0.01。WT表示转基因受体，GARR2KO 表示lncRNA25659转基因T3代株系。
[0025]图4：转基因受体、lncRNA25659转基因T3代株系第2叶鞘长。根据PCR产物测序鉴定的结果，选择基因型纯合的lncRNA25659转基因T3代株系与转基因受体测定第2叶鞘长，进行差异显著性分析。A)转基因受体、lncRNA25659转基因T3代株系第2叶鞘，标尺为1cm。B)转基因受体、lncRNA25659转基因T3代第2叶鞘长显著性测验，**表示P<0.01。WT表示转基因受体，GARR2KO表示lncRNA25659转基因T3代株系。
[0026]图5：转基因受体、lncRNA25659转基因T3代株系内源赤霉素含量。根据PCR产物测
序鉴定的结果，选择基因型纯合的lncRNA25659转基因T3代株系与转基因受体测定内源赤霉素含量，进
行差异显著性分析。**表示P<0.01，WT表示转基因受体，GARR2KO表示lncRNA25659转基因T3代株系。
具体实施方式
[0027]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0028]正如背景技术部分所介绍的，长链非编码RNA在转录与转录后水平调控多个生物学过程，在植物的生长发育中发挥重要作用，但与玉米株高相关的长链非编码RNA还未见报道。基于此，本发明提供一种与玉米株高相关的长链非编码RNA，并将其用于玉米株高改良的育种工作。
[0029]本发明将玉米自交系Mo17用水、10‑4M赤霉素GA
溶液处理，采用链特异性去核糖体
3
文库测序。根据链特异性去核糖体文库测序的结果，发现了长链非编码RNA lncRNA25659。lncRNA25659位于玉米第五染体，长度2809bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。[0030]由于核苷
酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该核苷酸具有90％以上同源性，且具有相同的功能，则均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
[0031]转录组测序结果表明赤霉素处理后，lncRNA25659表达量降低。本发明进一步使用RT‑PCR技术检测了lncRNA25659在水、赤霉素处理样品中的表达，实验结果证实赤霉素处理后lncRNA25659的表达降低。
[0032]在获得上述长链非编码RNA lncRNA25659之后，发明人将其转入受体植物玉米中，获得lncRNA25659的CRISPR/Cas9转基因株系。测定转基因受体、lncRNA25659纯合转基因株系的株高、第2叶鞘长、内源赤霉素含量等农艺生理指标，结果发现与转基因受体相比，
含量显著增加。lncRNA25659 CRISPR/Cas9转基因株系的株高、第2叶鞘长、内源赤霉素GA
3
[0033]综上，本发明克隆出一个新的玉米长链非编码RNA，并将其命名为lncRNA25659，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。赤霉素处理后该长链非编码RNA的表达降低；与转基因受
含量显著增体相比，lncRNA25659CRISPR/Cas9转基因株系株高、第2叶鞘长、内源赤霉素GA
3
加。结果表明，长链非编码RNA lncRNA25659参与赤霉素响应进而影响株高，由此提出了本发明。
[0034]基于本发明的玉米长链非编码RNA的性能，可以用于改良玉米的株高。在本发明的一种实施方案中，给出了改良植物株高的方法，包括下列步骤：
[0035](1)根据玉米长链非编码RNA lncRNA25659设计guide RNA(gRNA)；
[0036](2)将gRNA连接至植物CRISPR/Cas9载体上；
[0037](3)将带有gRNA质粒的农杆菌转入目标植物，获得lncRNA25659的CRISPR/Cas9转基因植物。
[0038]综上所述，本发明所提供的长链非编码RNA lncRNA25659的表达受到赤霉素处理抑制，利用植物CRISPR/Cas9载体，编辑lncRNA25659，可以改良植物的株高。
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