(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201610205670.6
(22)申请日 2016.04.02
CCTCC NO ：M 2016163 2016.04.01
C12N 15/52(2006.01)
C12N 9/00(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
(71)申请人华中农业大学
地址430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街
1号
(72)发明人刘子铎 张绍伟 林拥军 吴高兵
左武
(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001
代理人张红兵
(54)发明名称
及其应用
(57)摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一
种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因及其应
用。本发明公开了具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合
成酶基因exiGS 的序列和编码区，该基因的核苷
酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码446个氨基酸。
该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。
生物学功能验证证明该基因具有高活性，耐低温，
高温稳定性好，本发明初步验证了具有草铵膦抗
性的谷氨酰胺合成酶基因的功能及其在抗草铵膦
作物中的应用潜能。可广泛用于不同抗除草剂转
(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书9页序列表5页 附图6页CN 107022555 A 2017.08.08
C N 107022555
A
1.一种具有草铵膦抗性的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种具有草铵膦抗性的编码蛋白，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组的表达草铵膦抗性蛋白的大肠杆菌，
其特征在于该大肠杆菌的基因组中包含有权利要求1所述的编码基因。
4.权利要求1所述的编码基因在抗草铵膦转基因植物中的应用。
5.权利要求2所述的编码蛋白在抗草铵膦转基因植物中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 107022555 A
一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因及其应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因的分离鉴定。
背景技术
[0002]草铵膦(Glufosina te)是一种广泛使用的有机磷类除草剂，其有效成分是phosphinothricin(简称PPT)，L-PPT具有植物毒性，化学名称为(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵，是外消旋体混合物，属灭生性仿生茎叶处理剂。草铵膦的研制与开发是与双丙氨膦密切相关。双丙氨膦是从链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离提纯的一种三肽天然产物，双丙氨膦本身无除草活性，在植
物体内降解成具有除草活性的草铵膦。据此，德国艾格福公司直接合成草铵膦(Glufosinate)，成功开发出一个新除草剂品种。草铵膦制剂已被广泛使用在非耕地防除多种一年生和多年生禾本科草和阔叶草(Ahren W H et al 1994)。
[0003]由于草铵膦杀草谱广，在环境中迅速生物降解及对非靶生物低毒，因此如何将其作为作物田苗后选择性除草剂使用是十分必要的，而生物工程技术为此提供了可能。至今为止，在转基因抗除草剂作物研究与推广中，抗草铵膦作物仅次于抗草甘膦作物而居第2位，随着抗草铵膦作物种植面积的继续扩大，对抗草铵膦基因资源的需求也日益增大。然而如今对抗草铵膦作物的研究主要集中于发掘新的bar或pat抗除草剂基因，对草铵膦的靶标酶谷氨酰胺合成酶鲜有研究。
[0004]谷氨酰胺合成酶(GS，glutamine synthetase；EC 6.3.1.2)是生物体中最古老也是最广泛存在的酶(Kumada Y et al 1993)，它参与许多生物体中的氮和碳代谢。且是生物体氮代谢的关键酶之一，而生物体维持生命必须要有氮代谢作用，因此该酶对生物体是至关重要的。GS基因在细菌、真菌、植物体中均被广泛研究(Streicher S L et al 1980, Sampio M J et al 1979,Stacey G et al 1979)。
[0005]对植物而言，谷氨酰胺合成酶是一个重要的解毒酶，可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性。在正常情况下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamyl phosphate。但在PPT处理后，PPT先与ATP结合，磷酸化的PPT占据GS分子的8个反应中心，使GS的空间构型发生变化，从
而GS的活性受到抑制。PPT能抑制GS所有已知的形式，抑制的结果导致细胞内氨积累、氨基酸合成及光合作用受抑制、叶绿素破坏；但主要是通过对RuBp羧化酶/光呼吸作用迅速抑制造成引起植物死亡。除此之外，谷氨酰胺合成酶在植物体内具有多功能效应，向植物体内转入有效的外源GS基因或是超量表达GS酶，可以提高目标植物对草铵膦的抗性，同时也能增强植物抗土壤氮素贫瘠中、抗旱耐盐、抗强光照等特性。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种具有对高草铵膦耐受能力的谷氨酰胺合成酶及其编码
基因，为进一步通过基因工程的方法，构建具有草铵膦抗性的转基因植物提供基因资源。[0007]本发明的申请人从华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏的海洋菌中筛到一株高谷氨酰胺合成酶活性菌株N10-1，经16S鉴定该菌株为Exiguobacterium sp，申请人将该菌株命名为微小杆菌N10-1，Exiguobacterium sp.N10-1，于2016年4月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2016163。通过设计引物从该菌株的基因组中直接扩增得到exiGS基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长为1341bp，编码446个氨基酸。该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]将该基因连接到pGEX-6P-1表达载体(购自美国GE Healthcare公司)上，转化大肠杆菌Escherichia
coli BL21(购自Invitrogen公司)，转化后的重组菌能在含有400mM/L的草铵膦的培养基中生长，而空白对照则不能生长。申请人将这个基因命名为exiGS基因，功能验证表明exiGS基因对草铵膦具有很高的耐受性。除此之外，该基因所编码的谷氨酰胺合成酶(简称为ExiGS)能在低温下保持较高的活性，而且具有很好地热稳定性。ExiGS最适pH 为7.0，最适温度为35℃，在15℃保有50％左右的活性，在5℃时仍有20％左右的活性。经60℃处理一小时，相对活性仍剩余为50％左右。经测定发现该酶对草铵膦的K i为2.43±0.14mM,K i/K m为0.20±0.01，说明该基因对草铵膦确实具有很高的耐受性，在转基因植物中具有巨大的潜在应用价值。
附图说明
[0009]序列表SEQ ID NO:1是本发明分离的exiGS基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列(序列全长1341bp)。编码446个氨基酸。
[0010]序列表SEQ ID NO:2是本发明分离的exiGS基因编码的蛋白质序列。编码446个蛋白质。
[0011]序列表SEQ ID NO:3是鉴定微小杆菌N10-1的16SrDNA序列。
[0012]图1：本发明涉及的起始质粒pGEX-6p-1的图谱。
[0013]图2：是本发明制备的重组质粒pGEX-6p-1-exiGS的图谱。
[0014]图3：纯化后的重组谷氨酰氨合成酶ExiGS的SDS-PAGE分析。附图标记说明：泳道1：标准蛋白分子量；泳道2.含有pGEX-6p-1-exiGS重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的破细胞上清3.纯化的谷氨酰氨合成酶ExiGS。
[0015]图4：本发明的生物材料对草铵膦耐受性的试验结果。附图标记说明：图4中的A图是含有起始质粒pGEX-6p-1的大肠杆菌对草铵膦耐受性结果；图4中的B图是含有重组质粒pGEX-6p-1-exiGS的大肠杆菌对草铵膦耐受性结果。
[0016]图5：谷氨酰氨合成酶的最适反应温度的测试结果。
[0017]图6：谷氨酰氨合成酶的热稳定性的测试结果。
[0018]图7：是谷氨酰氨合成酶的最适pH的测试结果。
[0019]图8：是谷氨酰氨合成酶的pH稳定性的测试结果。
具体实施方式
[0020]实施例1：产谷氨酰胺合成酶的天然菌株的筛选
[0021](1)产谷氨酰胺合成酶的天然菌株的筛选：
[0022]申请人实验室从山东青岛附近海水中分离得到近200株海洋菌，将申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏的海洋菌株在高盐LB(1％的蛋白胨，0.5％酵母培养物和2％NaCl，pH7.0)平板上活化后，挑出单菌落在液体高盐LB培养基中培养，于28℃培养36小时后，用超声波(30HZ，400W)破碎细胞，分别对发酵后上清和细胞破碎后上清测定谷氨酰胺合成酶酶活(酶活测定方法如下所示)。经实验，筛选到一株编号为N10-1的高谷氨酰胺合成酶活性菌株，经16S鉴定该菌株为微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)菌株高度同源，申请人将该菌株命名为微小杆菌N10-1，Exiguobacterium sp.N10-1，于2016年4月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2016163。
[0023](2)谷氨酰胺合成酶活性测定方法：
[0024]谷氨酰胺合成酶活性测定混合物：18mM盐酸羟胺，0.36mM ADP，25mM磷酸二氢钠，135mM pH 7.0的咪唑-HCl缓冲液，0.27mM MnCl2，利用1M的盐酸或是2M的NaOH调节至所需pH。
[0025]酶活力测定终止混合物：3.3％FeCl3，2ml三氯醋酸，2.5ml浓盐酸。
[0026]酶活测定：取80μl不加入酶液的混合物加入10μl 200mM的L-谷氨酰胺于恒温水浴锅中保温5min，再加入10μl酶液(需适当稀释以使反应产生的谷氨酰羟肟酸(0.3-0.4mM左右)，继续保温30min，立即加入100μl反应终止液终止反应，摇匀离心后用多功能酶标仪测定OD540吸光值，以蒸馏水作对照。1U酶活
力单位定义为在上述标准条件下，每分钟催化形成1.0μmoL-谷氨酰羟肟酸所需的酶量。
[0027](3)16S鉴定步骤及引物
[0028]16S鉴定所用引物为通用引物27F，1492R。引物序列如下：
[0029]27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0030]1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
[0031]PCR体系如下：
[0032]
[0033]PCR条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒；60℃30秒；72℃60秒，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃5分钟结束。
[0034](4)谷氨酰胺合成酶活性菌株N10-1的菌学特征：
[0035]谷氨酰胺合成酶活性菌株N10-1细胞呈短杆状，属于革兰氏阳性菌，菌落酪黄，光滑，边缘规整，凸起。经16S rDNA鉴定后属于微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)本实施
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