(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010740340.3
(22)申请日 2020.07.28
(71)申请人 重庆澳龙生物制品有限公司
地址 402460 重庆市荣昌工业园区(板桥工
业园区四支路)
(72)发明人 冉智光 赵扬扬 吕航 赖茂林
伏刚 王盼举 古静 殷远滔
高洋
(74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限
公司 11228
代理人 武君
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 33/535(2006.01)
(54)发明名称
备方法和应用
(57)摘要
本发明公开了一种羊棘球蚴抗体ELISA检测
试剂盒及其制备方法和应用，属于生物检测技术
领域。羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒包括EG95
阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、底物显
体ELISA检测试剂盒，采用细粒棘球蚴EG95蛋白B
细胞表位特异性多肽抗原作为包被抗原，生产方
法简便、抗原纯度高。避免了大肠杆菌发酵产生
的复杂纯化步骤和杂蛋白干扰，适合大量血清样
品的检测，在进行动物疫病检测和流行病学调查
中，具有经济方便等优点，且检查成本低，利于推
广应用，在检测羊棘球蚴(包虫)EG95蛋白抗体
中，
具有广泛的应用前景。权利要求书2页 说明书17页序列表2页 附图3页CN 111896744 A 2020.11.06
C N 111896744
A
1.一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括EG95多肽抗原包被酶标板、稀释液、洗涤液、封闭液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗、底物显液、终止液和血清稀释板；
所述EG95多肽抗原为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液包括体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，浓度为200μL/L的防腐剂Proclin 300，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含2％明胶的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液为含有EG95抗体的羊血清；所述阴性对照液为健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清。
6.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG酶标二抗体。
7.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物显液包括溶液A和溶液B；所述溶液A包括体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述溶液B包括0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺的混合溶液。
8.根据权利要求1所述羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述EG95多肽抗原具有序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1至权利要求8任一所述检测羊棘球蚴EG95抗体试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
二抗保护剂的制备：取海藻糖、PEG(聚乙二醇)4000、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)K-30、PVA (聚乙烯醇)9000-10000、D-ribose(D-核糖)、1-甲基-2-吡咯烷酮、异噻唑啉酮，加蒸馏水定容，过滤除菌，即可；
包被缓冲液制备：取碳酸钠、碳酸氢钠，加蒸馏水，充分溶解，调pH值至9.6，定容，过滤除菌，即可；
稀释液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，Proclin 300防腐剂200μL/L，二抗保护剂1ml和pH值为7.4的1/15mol/L磷酸盐缓冲液的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
洗涤液的制备：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.5％的Tween-20和pH值为7.4的1/ 15mol/L磷酸盐缓冲液的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
封闭液的制备：用磷酸盐缓冲液配制含有2％明胶，Procline 300防腐剂200μL/L的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
阳性对照液的制备：以羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫制备的高免血清，作为储备阳性对照血清，将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为
0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无透明塑料管，50μL/支，作为阳性对照血清，于-20℃保存备用；
阴性对照液的制备：用健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清，作为储备阴性对照血清，将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无透明塑料管，50μL/支，作为阴性对照血清，于-20℃保存备用；
酶标二抗的制备：以辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG二抗体作为原液，使用二抗保护剂以1:200稀释后制得，200μL/支；
底物显液的制备：溶液A：用蒸馏水配制含体积百分含量为0.06％的双氧水和pH值为5.4的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合液，分装30mL/瓶，即可；溶液B：用蒸馏水配制含0.4g/L的乙二胺四乙酸二钠、1.9g/L的柠檬酸、100mL/L的甘油和0.3g/L四甲基联苯胺的混合溶液，分装30mL/瓶，即可；
终止液的制备：用蒸馏水配制含2mol/L硫酸溶液，分装15mL/瓶，即可；
EG95多肽抗原包被酶标板的制备：利用多肽合成仪合成SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，纯化后得EG95多肽抗原；用包被缓冲液将纯化后的EG95多肽抗原配制成浓度为4μg/mL，按100μL/孔，加入酶标板中，在4℃条件下，包被过夜14～18h，弃去包被缓冲液，洗涤，拍干，每孔加入200μL封闭液，在37℃条件下，封闭2h，弃去封闭液，洗涤，真空包装后置于4℃保存，即可。
10.如权利要求1至权利要求8任一所述检测羊棘球蚴EG95抗体试剂盒在检测绵羊/山羊血清中EG95抗体的应用。
一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]棘球蚴病又称包虫病，主要是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)中绦期幼虫—棘球蚴感染中间宿主而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。细粒棘球绦虫寄生在犬、狐狸、狼等动物小肠，棘
球蚴寄生于绵羊、山羊、牛(牦牛)、猪、骆驼等多种动物以及人的肝、肺等器官。该病严重威胁着人类健康和畜牧业发展，被世界卫生组织(WHO)列为17种被忽视的热带病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为需要报告的动物疫病，被欧盟列入严重关注的人畜共患病名单。自2005年以来，包虫病一直被纳入全国重点寄生虫病防治规划，《中华人民共和国传染病防治法》将人间包虫病列入丙类法定传染病名录，国家农业农村部将畜间包虫病列入二类动物疫病名录，是16种优先防控的动物疫病之一。长期以来，我国采取终末宿主犬驱虫和病人手术的防控措施，并没有切断中间宿主这一传播环节，因此，防控效果有限。羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗经国内外实验室和临床验证预防效果很好，在我国注册为一类新兽药。自2016年始，包虫病被列入为数不多的强制免疫动物疫病之一。
[0003]EG95蛋白是细粒棘球绦虫六钩蚴的天然抗原，是最有效的疫苗分子，是羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的保护性抗原成分。该蛋白存在多个有效B细胞和T细胞表位，能刺激机体产生良好的免疫应答。其中体液免疫应答与临床保护密切相关，可用于免疫监测和效果评估。
[0004]长期以来对羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗的免疫效果评估主要采用包被重组表达抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)，认为二免后2周至少80％试验羊血清ELISA抗体水平≥1.0，且二免后2周血清同一免前血清相比ELISA的P/N值均应≥2.0，为免疫有效，被检疫苗判为合格。但该方法重组抗原的制备需要经过重组工程菌发酵、细菌破碎、包涵体洗涤、包涵体变性、透析、过滤、亲和层析、凝血酶水解、聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定、抗原浓度测定等一系列繁琐操作步骤，生产工艺复杂；另外，该方法需要使
用细菌培养设备、超声破碎仪、透析设备、蛋白纯化仪、蛋白电泳仪等多种设备，不利于规模化生产；该方法生产的抗原含有微量的大肠杆菌杂蛋白，包被酶标板检测时，常存在假阳性情况，导致结果判定通常存在一定的误判。国内外用囊液抗原、裂解抗原、重组抗原进行了大量检测方法研究，要么敏感性不能达到临床免疫效果评价要求，要么特异性不佳(与其他羊寄生虫病的抗体有交叉反应)，检测效果均不理想，迄今为止，国内外仍没有商品化的相关检测试剂盒可资利用。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。
[0006]经研究，本发明采用以下技术方案：
[0007]一种羊棘球蚴抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括EG95多肽抗原包被酶标板、稀释液、洗涤液、封闭液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗、底物显液、终止液和血清稀释板；所述EG95多肽抗原为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0008]其中，所述EG95多肽抗原来源基因序列为细粒棘球蚴EG95全序列，其基因全序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。对该序列进行基因工程原核表达及Western Blot验证，具有良好的免疫原性。进一步通过Gene bank分析其相对保守的位点，并结合蛋白序列的β转向(Beta-Turn)
预测、表面可达性(Surface Accessibility)预测、柔性(Flexibility)预测、抗原性(Antigenicity)预测、亲水性(Hydrophilicity)预测等综合分析蛋白的B细胞表位(/home_v3.php)抗原表位区(AI)。并对候选多肽通过网络资源(如h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/p r o t s c a l e/及h t t p s:// /)进行疏水性及空间结构检测，得到如序列表所示的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4氨基酸序列作为EG95蛋白B细胞表位特异性多肽抗原。
[0009]优选的，EG95多肽抗原包被酶标板即为包被有合成的EG95多肽抗原的可拆聚苯乙烯酶联反应板。
[0010]优选的，所述稀释液包括体积百分含量为0.5‰的Tween-20，质量百分含量为1‰的BSA，浓度为200μL/L的防腐剂Proclin 300，二抗保护剂1mL和pH值为7.4的10×(1/ 15mol/L磷酸盐缓冲液)。
[0011]优选的，所述洗涤液包括0.5％(V/V)的Tween-20和pH值为7.4的10×(1/15mol/L 磷酸盐缓冲液)。
[0012]优选的，所述封闭液为含2％明胶的磷酸盐缓冲液。
[0013]优选的，所述阳性对照液为含有EG95抗体的羊血清；所述阴性对照液为健康未免疫羊棘球蚴疫苗的羊血清。
[0014]其中，阳性对照液具体为：以羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗免疫制备高免血清，当琼扩抗
体效价达到1:3～1:4时，经颈静脉无菌采集血液，常规分离血清，进一步过滤除菌后分装，作为储备阳性对照血清。将储备阳性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA测定，根据测定的OD450nm值，用高OD450nm值或阴性血清，调整到OD450nm值为1.9±0.1，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5ml无透明塑料管，50μL/支，作为阳性对照液在-20℃保存备用。
[0015]阴性对照液具体为：用来自非疫区的经琼脂扩散试验(AGP)检测棘球蚴(包虫) EG95抗体阴性的2～4月龄健康羔羊，经颈静脉无菌采集血液，常规分离血清，进一步过滤除菌后分装，作为储备阴性对照血清。将储备阴性对照血清以EG95多肽抗原包被板进行ELISA 测定，将不同OD450nm值的储备阴性对照血清混合，调整OD450nm值为0.15±0.04，加入终浓度为0.02％的Proclin 300防腐剂，分装至1.5mL无透明塑料管，50μL/支，作为阴性对照液。
[0016]优选的，所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG酶标二抗体。具体为：是以辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG二抗体(购自Earthox Life Sciences公司)作为原液
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